칩온칩

ChIP-on-chip
Chip-on-chip 실험의 워크플로우 개요

Chip-on-chip(Chip-chip이라고도 함)은 염색질 면역소모화('ChIP')와 DNA 마이크로어레이("칩")를 결합한 기술이다. 일반 Chip과 마찬가지로 Chip-on-chip은 체내 단백질과 DNA 사이의 상호작용을 조사하는 데 사용된다. 구체적으로 DNA 결합 단백질에 대한 결합 부위의 합인 시스트롬의 식별을 게놈 범위 기준으로 허용한다.[1] 거의 모든 관심 단백질의 결합 부위의 위치를 결정하기 위해 전유전자 분석을 수행할 수 있다.[1] 기법의 이름이 시사하듯이, 그러한 단백질은 일반적으로 염색질의 맥락에서 작용하는 단백질이다. 이 세분류의 가장 두드러진 대표자는 전사인자, 복제 관련 단백질, 원산지 인식 복합 단백질(ORC), 히스톤, 그 변형, 히스톤 수정 등이다.

Chip-on-chip의 목표는 게놈에서 기능적 요소를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 단백질 결합 사이트를 찾는 것이다. 예를 들어 관심 단백질로서 전사 인자의 경우 게놈 전체에서 전사 인자 결합 부위를 결정할 수 있다. 다른 단백질은 촉진자 지역, 촉진자, 억제자 및 소음 요소, 절연체, 경계 요소 및 DNA 복제를 제어하는 시퀀스의 식별을 허용한다.[2] 히스톤이 관심 대상인 경우, 수정사항의 분포와 해당 지역화가 규제 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다고 생각된다.

Chip-on-chip은 다양한 생리학적 조건에서 모든 단백질-DNA 상호작용을 나열하는 (선택된) 유기체의 카탈로그를 만드는 것을 목적으로 설계되었다. 이러한 지식은 궁극적으로 유전자 조절, 세포 증식, 질병 진행의 이면에 있는 기계의 이해에 도움이 될 것이다. 따라서 Chip-on-chip은 후생유전학 연구에 의해 전파됨에 따라 뉴클레오티드 수준의 게놈 조정에 대한 우리의 지식과 더 높은 수준의 정보와 규제에 대한 정보를 보완할 수 있는 잠재력을 제공한다.

기술 플랫폼

참고 항목: DNA 마이크로어레이 및 면역복구

Chip-on-chip 실험을 수행하기 위한 기술적 플랫폼은 DNA 마이크로레이 또는 "칩"이다. 다음과 같은 다양한 특성에 따라 분류 및 구분할 수 있다.

프로브 유형: DNA 배열은 기계적으로 점화된 cDNA 또는 PCR 제품, 기계적으로 점화된 올리고뉴클레오티드 또는 현장에서 합성된 올리고뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 초기의 미세 광선은 표현된 유전체 영역(ORF라고 하는 개방형 판독 프레임)에서 RNA를 검출하도록 설계되었다. 그러한 배열들은 유전자 발현 프로파일을 연구하는 데 완벽하게 적합하지만, 이 기술과 관련된 대부분의 "흥미로운" 단백질들이 유전자간 영역에서 결합되기 때문에 Chip 실험에서는 제한적인 중요성을 가지고 있다. 요즘은 맞춤형 배열도 실험의 요건에 맞게 설계하고 미세 조정할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드의 모든 염기서열은 유전적 영역뿐만 아니라 유전적 영역을 포괄하도록 합성될 수 있다.

프로브 크기: 초기 버전의 cDNA 어레이는 프로브 길이가 약 200bp이었다. 최신 어레이 버전에서는 25메릭스(Affymetrix)에 이르는 70-(마이크로레이, Inc.)의 짧은 올리고를 사용한다. (2007년 2월)

프로브 구성: 타일 및 비타일 DNA 배열이 있다. 비타일 배열은 비공간 기준에 따라 선택된 프로브를 사용한다. 즉, 프로브로 사용되는 DNA 시퀀스는 게놈에 고정된 거리가 없다. 그러나 타일 배열은 게놈 영역(또는 전체 게놈)을 선택하여 동일한 덩어리로 나눈다. 그러한 지역을 타일 경로라고 한다. 인접한 청크의 각 쌍 사이의 평균 거리는 타일 경로의 분해능을 제공한다. 경로는 겹치거나, 끝에서 끝까지 또는 간격을 둘 수 있다.[3]

배열 크기: Chip-on-Chip에 사용된 첫 번째 마이크로레이에는 효모 게놈의 모든 ORF와 유전자간 영역을 나타내는 약 13,000개의 점점이 있는 DNA 세그먼트가 포함되어 있었다.[2] 오늘날, Apfymetrix는 분해능 5bp(모두 320만 개의 프로브)의 전유전자 타일 효모 어레이를 제공한다. 인간 게놈을 위한 타일 배열도 점점 더 강력해진다. 예를 하나 들어, Apfymetrix는 약 9천만 개의 탐침을 가진 7개의 배열 세트를 제공하며, 약 35bp 간격으로 인간 게놈의 완전한 비복제 부분에 걸쳐 있다.(2007년 2월) 실제 마이크로 어레이 외에도 Chip-on-chip 실험을 실행하기 위해서는 다른 하드 및 소프트웨어 장비가 필요하다. 일반적으로 한 회사의 마이크로레이는 다른 회사의 가공 하드웨어로 분석할 수 없는 경우다. 따라서 어레이를 구입하려면 관련 워크플로우 장비도 구입해야 한다. 가장 중요한 요소는 무엇보다 원시 데이터의 후속 수치 분석을 위한 하이브리드화 오븐, 칩 스캐너, 소프트웨어 패키지 등이다.

Chip-on-chip 실험의 워크플로우

생물학적 질문부터 시작하여 Chip-on-chip 실험은 크게 세 단계로 나눌 수 있다. 첫 번째는 적절한 배열과 프로브 유형을 선택하여 실험을 설정하고 설계하는 것이다. 둘째, 실제 실험은 습식 실험실에서 실시한다. 마지막으로, 사이클의 드라이랩 부분 동안 수집된 데이터를 분석하여 초기 질문에 답하거나 새로운 질문으로 유도하여 사이클이 다시 시작될 수 있도록 한다.

워크플로의 습식 랩 부분

Chip-on-chip 실험의 Wet-lab 부분에 대한 워크플로우 개요.

첫 번째 단계에서 관심 단백질(POI)은 체외 환경에서 결합되는 DNA 사이트와 교차 연결된다. 보통 이것은 열로 되돌릴 수 있는 부드러운 포름알데히드 고정법에 의해 이루어진다.

그리고 나서, 세포들은 라이스를 맞고 DNA는 소음을 내거나 마이크로코크칼 누클렌즈를 사용하여 깎인다. 이것은 DNA 조각의 이중 가닥 덩어리가 되는 결과를 낳는데, 보통 길이가 1kb 이하인 것이다. POI와 교차 연결된 이들은 POI-DNA 콤플렉스를 형성한다.

다음 단계에서는 이러한 콤플렉스만 POI에 특화된 항체를 사용하여 DNA 파편 집합에서 걸러진다. 항체는 단단한 표면에 부착될 수도 있고, 자석 비드가 있을 수도 있으며, 교차 연결 콤플렉스와 결합되지 않은 파편들을 분리할 수 있는 다른 물리적 성질을 가질 수도 있다. 이 절차는 근본적으로 단백질의 면역복귀(IP)이다. 이것은 항체가 있는 태깅된 단백질을 태그에 붙여서 할 수 있다(예: 플래그, HA, c-myc) 또는 고유 단백질에 대한 항체가 있는 경우.

POI-DNA 콤플렉스의 교차 링크는 (보통 난방에 의해) 역전되어 DNA 가닥이 정화된다. 나머지 워크플로의 경우 POI가 더 이상 필요하지 않다.

증폭과 변성 단계를 거쳐 단일 가닥의 DNA 파편에는 Cy5나 알렉사 647과 같은 형광 태그가 부착된다.

마지막으로, 이 파편들은 관심의 유전적 부분을 덮는 짧은 단일 가닥 시퀀스로 포착되는 DNA 마이크로 배열의 표면 위로 쏟아진다. 라벨이 부착된 파편이 배열에서 보완적인 파편을 "찾을" 때마다, 그들은 혼합되어 이중 가닥의 DNA 파편을 다시 형성할 것이다.

워크플로의 드라이랩 부분

참고 항목: DNA 마이크로 어레이
Chip-on-chip 실험의 Dry-lab 부분에 대한 워크플로우 개요.

혼합이 가능하도록 충분히 큰 시간 프레임이 지나면 어레이에 형광등이 켜진다. 라벨이 부착된 조각들 중 하나에 혼합된 어레이의 프로브는 카메라에 포착되는 광 신호를 방출한다. 이 이미지에는 워크플로의 나머지 부분에 대한 모든 원시 데이터가 들어 있다.

거짓 컬러 영상으로 인코딩된 이 원시 데이터는 실제 분석이 가능하기 전에 숫자 값으로 변환할 필요가 있다. 원시 데이터의 분석과 정보 추출은 종종 Chip-on-chip 실험에서 가장 어려운 부분으로 남아 있다. 초기 칩 판독부터 배경 노이즈를 뺄 수 있는 적절한 방법, 그리고 마지막으로 데이터를 정상화하고 이후의 통계 분석에 사용할 수 있는 적절한 알고리즘에 이르기까지 워크플로우의 이 부분에 걸쳐 문제가 발생하며, 이는 생물학적 질문에 대한 더 나은 이해로 이어질 것이다.그 실험은 다루려고 한다. 나아가 어레이 플랫폼이 다르고, 그 간 표준화도 미흡해 데이터 스토리지와 교환이 큰 문제다. 일반적으로 데이터 분석은 크게 세 단계로 나눌 수 있다.

첫 번째 단계 동안 어레이에서 캡처된 형광 신호는 동일하거나 두 번째 칩에서 파생된 제어 신호를 사용하여 정규화된다. 그러한 제어 신호는 어레이에서 어떤 프로브가 올바르게 혼합되었는지와 특정하지 않게 바인딩되었는지 알려준다.

두 번째 단계에서는 게놈을 따라 POI가 풍부한 영역을 식별하기 위한 제어 데이터와 IP 부분 데이터에 수치 및 통계적 테스트를 적용한다. 중위 백분위수 순위, 단일 배열 오류, 슬라이딩 창 등 세 가지 방법이 광범위하게 사용된다. 이러한 방법은 일반적으로 저강도 신호를 처리하는 방법, 배경 노이즈의 허용량, 그리고 계산 중에 데이터의 어떤 특성이 강조되는가에 따라 다르다. 최근에는 미닫이창 접근법이 선호되는 듯하며 종종 가장 강력한 것으로 묘사된다.

3단계에서는 이들 지역을 더 분석한다. 예를 들어, 만약 POI가 전사적 요소라면, 그러한 지역은 그것의 결합 사이트를 나타낼 것이다. 이후 분석은 게놈의 기능적 주석을 허용하기 위해 뉴클레오티드 모티브와 다른 패턴을 유추하고자 할 수 있다.[4]

장단점

타일 어레이를 사용하여 Chip-on-chip은 게놈 전체 지도를 고해상도화할 수 있다. 이 지도들은 전사 인자와 같은 많은 DNA 결합 단백질의 결합 부위를 결정할 수 있고 또한 염색체 변형도 확인할 수 있다.

비록 Chip-on-chip은 유전체학 분야에서 강력한 기술이 될 수 있지만, 그것은 매우 비싸다. Chip-on-chip을 사용하여 발표된 대부분의 연구들은 생물학적으로 의미 있는 지도를 보장하기 위해 그들의 실험을 최소한 세 번 반복한다. DNA 마이크로레이 비용은 종종 실험실이 Chip-on-chip 실험을 진행해야 하는지에 대한 제한적인 요인이 된다. 또 다른 한계는 달성할 수 있는 DNA 조각의 크기다. 대부분의 Chip-on-chip 프로토콜은 DNA를 잘게 분해하는 방법으로 소음을 이용한다. 그러나 소음을 내는 것은 200bp의 최소 조각 크기로 제한된다. 고해상도 맵의 경우 이러한 한계를 극복하여 더 작은 조각, 가급적 단일 핵 분해능을 달성해야 한다. 앞서 언급했듯이 어레이에서 생성되는 방대한 양의 데이터에 대한 통계적 분석은 난제로, 정규화 절차는 유물을 최소화하고 생물학적으로 정말 중요한 것을 결정하는 것을 목표로 해야 한다. 지금까지 포유류 게놈에 대한 적용은 주요 한계였는데, 예를 들어, 반복적으로 점유되는 게놈의 상당한 비율 때문이다. 그러나 Chip-on-chip 기술이 발전함에 따라 고해상도 전체 포유류 게놈 지도를 달성할 수 있어야 한다.

Chip-on-chip에 사용되는 항체는 중요한 제한 요인이 될 수 있다. ChIP-on-chip은 자유 용액에서 그리고 고정된 조건에서도 그것의 비문을 인식해야 하는 고도로 구체적인 항체를 요구한다. 교차연계 염색질을 면역복제하는 데 성공하는 것으로 증명되면, 「ChIP급」이라고 한다. ChIP급 항체를 제공하는 회사로는 Abcam, Cell Signal Technology, Santa Cruz, Upstate 등이 있다. 특이성 문제를 극복하기 위해 관심 단백질을 항체가 인식하는 플래그나 HA와 같은 태그에 융합시킬 수 있다. 항체가 필요 없는 Chip-on-chip의 대안은 DamID이다.

또한 H3 tri methyl K4와 같은 특정 히스톤 변형에 대한 항체도 이용할 수 있다. 앞서 언급했듯이, 이러한 항체와 Chip-on-chip의 조합은 히스톤 수정 패턴의 전체 게놈 분석을 결정하는 데 매우 강력해졌고 히스톤 코드와 후생유전학에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 것이다.

DNA 결합 단백질의 비특이성을 입증하는 연구가 PLoS Biology에 발표되었다. 이것은 기능 관련성의 대체 확인이 Chip-chip 실험에서 필요한 단계임을 나타낸다.[5]

역사

1999년에 첫 번째 Chip-on-chip 실험은 싹트는 효모 염색체 III에 따른 응집력의 분포를 분석하기 위해 수행되었다.[6] 게놈을 완전히 표현하지는 못했지만, 본 연구의 프로토콜은 이후의 연구에서 사용된 것과 동등한 것으로 남아 있다. 그 후 게놈의 모든 ORF를 사용한 Chip-on-chip 기법은 2000년과 2001년에 발표된 3개의 논문에서 성공적으로 적용되었다.[7][8][9] 저자들은 싹트고 있는 효모 사카로마이오스 세레비시아에서 개별 전사 인자의 결합 부지를 확인했다. 2002년 리처드 영의[10] 그룹은 효모에 c-Myc 태깅 시스템을 사용하여 106개의 전사 인자의 게놈 넓은 위치를 결정했다. 포유류 치프온칩 기법의 첫 시연은 약하고 강한 E2F 결합 사이트가 함유된 9개의 염색체 파편을 분리하는 작업을 페기 판햄의 연구소가 마이클 장 연구소의 연구소와 공동으로 실시하여 2001년에 발표했다고 보고하였다.[11] 이 연구는 E2F 표적이 DNA 손상 검문소 및 수리 경로의 구성요소와 염색체 결합/응축, 염색체 관련 요인을 인코딩하는 것을 처음으로 보여주기 위해 Chip-on-chip 기술을 사용한 Brian Dynlacht의 연구소와 영 연구실 간의 협업을 통해 수개월 후에 추적되었다.분리, 그리고 유사분열 스핀들[12] 체크포인트 Chip-on-chip을 위한 다른 애플리케이션에는 DNA 복제, 재결합 및 염색질 구조가 포함된다. 그 이후로, Chip-on-chip은 히스톤 수정과 더 많은 전사 인자의 게놈 전체 지도를 결정하는 강력한 도구가 되었다. 포유류 시스템의 Chip-on-chip은 크고 반복적인 게놈 때문에 어려웠다. 따라서 포유류 세포에 대한 많은 연구는 전사 인자를 결합할 것으로 예측되는 엄선된 촉진자 지역에 초점을 맞추고 있으며 전체 게놈을 분석하지 않았다. 그러나 최근 님블겐과 같은 회사로부터 전체 포유류 게놈 배열을 상업적으로 이용할 수 있게 되었다. 앞으로 치프온칩 배열이 점점 고도화됨에 따라 포유류용 DNA 결합 단백질과 염색질 성분의 고해상도 전체 게놈 지도를 보다 상세하게 분석할 예정이다.

대안

2007년 도입된 Chip-seq(Chip-seq) 시퀀싱은 관심 단백질을 DNA와 교차 연결하기 위해 염색질 면역소모제를 사용하는 기술이지만 마이크로 어레이를 사용하는 대신 보다 정확하고 높은 처리량 시퀀싱 방법을 사용해 상호작용 지점을 국산화한다.[13]

DamID는 항체가 필요 없는 대안 방법이다.

Chip-exo는 exonuclease 처리를 사용하여 최대 단일 기본 쌍 분해능을 달성한다.

CUT&RUN 시퀀싱은 Chip의 기술적 한계를 해결하기 위해 표적 효소 분리가 있는 항체 인식을 사용한다.

참조

  1. ^ a b Aparicio, O; Geisberg, JV; Struhl, K (2004). Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Vol. Chapter 17. University of Southern California, Los Angeles, California, USA: John Wiley & Sons, Inc. pp. Unit 17.7. doi:10.1002/0471143030.cb1707s23. ISBN 978-0-471-14303-1. ISSN 1934-2616. PMID 18228445. S2CID 30456067.
  2. ^ a b M.J. Buck, J.D. Lib, Chip-chip: 게놈 범위 염색질 면역소모화 실험, Genomics 83(2004) 349-360의 설계, 분석, 적용에 대한 고려사항.
  3. ^ 로이스 테, 로조스키 JS, 베르토네 P, 사만타 M, 스톨크 V, 와이스만 S, 스나이더 M, 게르슈타인 M. 관련 조항. 대본 매핑을 위한 올리고뉴클레오티드 타일링 마이크로레이 분석의 문제점. TrendsGenet. 2005년 8월 21일 (8):466-75. 검토
  4. ^ "Biomedical Genomics Core - The Research Institute at Nationwide Children's Hospital". genomics.nchresearch.org.
  5. ^ Li, Xiao-Yong; MacArthur, Stewart; Bourgon, Richard; Nix, David; Pollard, Daniel A.; Iyer, Venky N.; Hechmer, Aaron; Simirenko, Lisa; Stapleton, Mark; Hendriks, Cris L. Luengo; Chu, Hou Cheng; Ogawa, Nobuo; Inwood, William; Sementchenko, Victor; Beaton, Amy; Weiszmann, Richard; Celniker, Susan E.; Knowles, David W.; Gingeras, Tom; Speed, Terence P.; Eisen, Michael B.; Biggin, Mark D. (2008). "Transcription Factors Bind Thousands of Active and Inactive Regions in the Drosophila Blastoderm". PLOS Biology. 6 (2): e27. doi:10.1371/journal.pbio.0060027. PMC 2235902. PMID 18271625.
  6. ^ Blair Y, Kleckner N, Coezins는 팔과 중심 영역인 Cell(1999) 7월 23일:98(2:249-59)을 따라 효모 염색체 III를 따라 선호 부위에 결합한다.
  7. ^ J.D.리브.X.류.D. Botstein, P.O. Brown, 프로모터별 Rap1 바인딩 단백질-DNA 연합의 게놈 범위 지도에 의해 밝혀졌다. 지네. 28(2001) 327-334.
  8. ^ B. Ren, F. Robert, J.J. Wyrick, O. Aparicio, E.G. Jennings, I. Simon, J. Zeitlinger, J. Schreiber, N. Nannett, E. Kanin, T.L. Volkert, C.J. Wilson, S.R. Bell, R.A. Young, Genome-wide location and function of DNA binding proteins, Science 290 (2000) 2306-2309.
  9. ^ V.R. 아이어, C.E. 호락, C.S. 스카프, D. Botstein, M. Snyder, P.O. Brown, 효모세포주기 전사인자 SBF와 MBF, Nature 409(2001) 533-538.
  10. ^ T.I. Lee, N.J. 리날디, F. Robert, D.T. Odom, Z. 바-조셉, G.K. 게르버, N.M. 하넷, C.T. 하비슨, C.M. 톰슨, I. 사이먼, J. 자이틀링거, E.G. 제닝스, H.L. 머레이, D.B. 고든, B. Ren, J.J. Wyrick, J.B Tagne, T.L. Volkert, E. Fraenkel, D.K. Gifford, R.Saccharomyces serebisiae, Science 298 (2002) 799-804의 젊은 전사적 규제 네트워크.
  11. ^ 베인만 AS, 바틀리 SM, 장 T, 장 MQ, 판햄 PJ. 새로운 E2F 표적 촉진자, 분자 및 세포 생물학 20(2001)6820-32를 복제하기 위한 염색체 면역복제 사용.
  12. ^ 렌 B, 캠 H, 타카하시 Y, 볼커트 T, 테라그니 J, 영 RA, Dynlacht BD. E2F는 세포 주기 진행과 DNA 수리를 통합하고 G2(M) 체크포인트인 유전자와 개발 16(2002) 245-56을 통합한다.
  13. ^ Johnson, David S.; Mortazavi, Ali; Myers, Richard M.; Wold, Barbara (8 June 2007). "Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions". Science. 316 (5830): 1497–1502. doi:10.1126/science.1141319. PMID 17540862. S2CID 519841.

추가 읽기

외부 링크

분석 및 소프트웨어

  • [1] CoCAS: Agilent Chip-on-Chip 실험을 위한 무료 분석 소프트웨어
  • [2] rMAT: 타일링 어레이 및 Chip-chip 데이터를 정규화하고 분석하기 위한 MAT 프로그램의 R 구현.