DNA 구성

DNA construct

DNA 구조는 표적 조직이나 세포에 유전 물질을 통합하는 데 사용될 수 있는 벡터 위에서 인공적으로 설계된 DNA의 부분이다.[1] DNA 구성물은 트랜스젠이라고 불리는 DNA 삽입물을 포함하며, 변환 벡터를 통해 전달되어 삽입 시퀀스를 복제하거나 대상 셀에 표시할 수 있다. 이 유전자는 자연적으로 발생하는 유전자로부터 복제될 수도 있고,[2] 또는 합성적으로 구성될 수도 있다.[3] 벡터는 물리적, 화학적 또는 바이러스적 방법을 사용하여 전달될 수 있다.[4] 일반적으로 DNA 구성에 사용되는 벡터에는 복제의 기원, 다중 복제 사이트 및 선택 가능한 마커가 포함되어 있다.[2] 특정 벡터는 관련된 표현 시스템에 기초하여 추가적인 규제 요소를 운반할 수 있다.[5]

DNA 구성물은 플라스미드나 박테리오파지와 같은 벡터를 사용하여 단일 유전자를 운반하는 수천 개의 염기쌍(kbp)만큼 작거나 인공 염색체를 사용하는 대규모 유전체 연구에 수백 kbp의 크기일 수 있다.[2] DNA구성은 야생형 단백질을 표현하거나, 경쟁자나 억제제를 표현하여 특정 유전자의 발현을 막거나, 삭제 돌연변이나 오식 돌연변이와 같은 돌연변이 단백질을 표현할 수 있다. DNA 구조는 DNA 염기서열, 단백질 표현, RNA 연구와 같은 기술을 위한 분자생물학 연구에서 널리 채택되고 있다.[5]

역사

최초의 표준화된 벡터인 pBR220은 허버트 보이어의 연구소에 있는 연구자들에 의해 1977년에 설계되었다. 플라스미드는 다양한 제한 효소 부위와 트랜스폰 활동에서 자유로운 안정적인 항생제 내성 유전자를 함유하고 있다.[6]

1982년 제프리 비에이라(Jeffrey Vieira)와 요아힘 메싱(Joachim Matching)은 다중 복제 사이트로 구성되며 범용 M13 프라이머 세트를 사용하여 보다 효율적인 시퀀싱과 복제를 가능하게 하는 M13mp7에서 파생된 pUC 벡터의 개발에 대해 설명했다. 3년 후, 현재 인기 있는 pUC19 플라스미드는 같은 과학자들에 의해 설계되었다.[7]

건설

관심의 DNA 염기서열에 있는 유전자는 기존 염기서열에서 복제되거나 합성적으로 개발될 수 있다. 유기체에서 자연적으로 발생하는 염기서열을 복제하기 위해 우선 대상 유전자 주변에서 DNA 염기서열을 인식해 절단하는 제한효소로 유기체의 DNA를 절단한다. 그러면 이 유전자는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 증폭될 수 있다. 일반적으로 이 프로세스에는 목표 시퀀스에 초기에 혼합하기 위해 프라이머로 알려진 짧은 시퀀스를 사용하는 것이 포함된다. 또한, 프라이머 시퀀스에 포인트 돌연변이를 도입한 후 목표 시퀀스를 수정하기 위해 각 사이클에 복사할 수 있다.[2]

DNA 구조를 위해 표적 DNA 가닥을 합성하는 것도 가능하다. 올리고뉴클레오티드라고 알려진 DNA의 짧은 가닥은 고체상에 부착된 DNA 가닥에 기초가 한 번에 하나씩 추가되는 기둥 기반 합성을 이용해 개발할 수 있다. 각 베이스에는 다음 베이스가 추가될 준비가 될 때까지 제거되지 않는 연결을 방지하기 위한 보호 그룹이 있어, 정확한 순서로 연결되도록 한다. 올리고뉴클레오티드도 마이크로 어레이에서 합성할 수 있어 수만 개의 시퀀스를 한꺼번에 합성할 수 있어 비용을 절감할 수 있다.[3] 더 큰 유전자를 합성하기 위해 끝에 겹치는 염기서열로 올리고뉴클레오티드를 개발한 다음 함께 결합한다. 가장 일반적인 방법은 중합효소 사이클링 조립체(PCA)라고 하는데, 조각은 겹치는 부위에서 혼합되어 확장되며, 각 사이클마다 더 큰 조각이 만들어진다.[2]

시퀀스가 분리되면 벡터에 삽입해야 한다. 이를 위한 가장 쉬운 방법은 제한효소를 사용하여 벡터 DNA를 절단하는 것이다. 만약 동일한 효소가 목표 염기서열을 분리하는 데 사용되었다면, 각 끝에서 같은 "오버행" 염기서열이 생성되어 혼합이 가능할 것이다. 일단 표적 유전자가 벡터 DNA에 교배되면, 그들은 DNA 리게아제를 사용하여 결합될 수 있다.[2] 대안적 전략은 대상 유전자의 동질적 사이트와 벡터 시퀀스 사이의 재조합을 사용하여 제한 효소의 필요성을 제거한다.[8]

배달 모드

DNA 구성 전달에는 물리, 화학, 바이러스 등 세 가지 범주가 있다.[4] 세포에 물리적으로 침투하여 DNA를 전달하는 물리적인 방법으로는 미세주사, 전기수술, 생물학 등이 있다.[9] 화학적 방법은 DNA를 전달하기 위해 화학반응에 의존하며 지질 나노입자를 통한 전달은 물론 인산칼슘을 사용하여 유능하게 만들어진 세포와의 변환을 포함한다.[10][11] 바이러스 방법은 다양한 바이러스 벡터를 사용하여 DNA를 전달하는데 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스를[12] 포함한다.

벡터 구조

대상 유전자 외에도 벡터에는 복제의 기원, 선택 가능한 표식기, 다중 복제 사이트 등 세 가지 중요한 요소가 있다. 복제의 기원은 DNA 복제 과정을 시작하는 DNA 염기서열로 벡터가 스스로 복제할 수 있게 한다. 다중 복제 사이트는 여러 제한 효소를 위한 결합 사이트를 포함하고 있어 벡터에 서로 다른 DNA 시퀀스를 삽입하는 것이 더 쉽다. 선택 가능한 마커는 호스트 셀에서 쉽게 선택할 수 있는 몇 가지 특성을 혼동하여 변환의 성공 여부를 결정할 수 있다. 가장 흔한 선택 가능한 표지는 항생제 내성을 위한 유전자로, 항체에 노출되면 구조가 없는 숙주세포가 소멸하고 해당 구조를 가진 숙주세포만 남게 된다.[2]

DNA 구성의 유형

일반적으로 사용되는 플라스미드 벡터, pET28a[13]
  • 박테리아 플라스미드는 박테리아에서 자연적으로 복제되는 DNA의 원형 부분이다.[2] 플라스미드는 삽입물을 약 20kbp 길이로 고정할 수 있다. 이러한 유형의 구성품에는 일반적으로 항생제 내성, 복제의 기원, Lac 억제제, 폴리링크커, 단백질 정화를 촉진하는 단백질 태그와 같은 규제 요소를 제공하는 유전자를 포함한다.[14]
  • 박테리오파지 벡터는 박테리아를 감염시키고 자신의 DNA를 복제할 수 있는 바이러스다.[2]
  • 인공 염색체는 최대 350kbp의 삽입물을 담을 수 있는 능력 때문에 게놈 프로젝트 연구에서 흔히 사용된다. 이러한 벡터는 F 인자에 의해 도입된 높은 안정성과 결합 능력을 이용하여 F 플라스미드에서 유도된다.[15]
  • Fosmids는 박테리아 F 플라스미드와 λ 페이지 복제 기술 사이의 혼합물이다. 삽입물은 페이지 입자로 미리 포장한 다음 45kbp까지 고정할 수 있는 기능으로 호스트 셀에 삽입된다. 그것들은 일반적으로 안정성이 향상되었기 때문에 DNA 라이브러리를 생성하는데 사용된다.[16]

적용들

DNA 구조는 자연적으로 발생하는 단백질과 공학적 돌연변이 단백질 모두를 포함한 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 단백질들은 약이나 항체와 같은 치료용 제품을 만드는 데 사용될 수 있다. DNA 구성물은 또한 촉진제나 억제제와 같은 규제적 순서를 표현함으로써 다른 유전자의 표현 수준을 바꿀 수 있다. 또한, 유전자 도서관 생성, 복제 DNA 염기서열 분석, RNA와 단백질 표현 연구와 같은 연구에 DNA 구성물을 사용할 수 있다.[5]

참고 항목

참조

  1. ^ Pinkert, Carl (2014). Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Amsterdam: Elsevier. p. 692. ISBN 9780124095366.
  2. ^ a b c d e f g h i Carter, Matt; Shieh, Jennifer C. (2010), "Molecular Cloning and Recombinant DNA Technology", Guide to Research Techniques in Neuroscience, Elsevier, pp. 207–227, doi:10.1016/b978-0-12-374849-2.00009-4, ISBN 978-0-12-374849-2, retrieved 2021-11-10
  3. ^ a b Hughes, Randall A.; Ellington, Andrew D. (January 2017). "Synthetic DNA Synthesis and Assembly: Putting the Synthetic in Synthetic Biology". Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1): a023812. doi:10.1101/cshperspect.a023812. ISSN 1943-0264. PMC 5204324. PMID 28049645.
  4. ^ a b Carter, Matt; Shieh, Jennifer C. (2010), "Gene Delivery Strategies", Guide to Research Techniques in Neuroscience, Elsevier, pp. 229–242, doi:10.1016/b978-0-12-374849-2.00010-0, ISBN 978-0-12-374849-2, retrieved 2020-10-24
  5. ^ a b c Glick, Bernard R.; Patten, Cheryl L. (2017). Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press.
  6. ^ Bolivar, Francisco; Rodriguez, Raymond L.; Betlach, Mary C.; Boyer, Herbert W. (1977-11-01). "Construction and characterization of new cloning vehicles I. Ampicillin-resistant derivatives of the plasmid pMB9". Gene. 2 (2): 75–93. doi:10.1016/0378-1119(77)90074-9. ISSN 0378-1119. PMID 344136.
  7. ^ Yanisch-Perron, Celeste; Vieira, Jeffrey; Messing, Joachim (1985-01-01). "Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors". Gene. 33 (1): 103–119. doi:10.1016/0378-1119(85)90120-9. ISSN 0378-1119. PMID 2985470.
  8. ^ Copeland, Neal G.; Jenkins, Nancy A.; Court, Donald L. (October 2001). "Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics". Nature Reviews Genetics. 2 (10): 769–779. doi:10.1038/35093556. ISSN 1471-0064. PMID 11584293. S2CID 10916548.
  9. ^ Mehierhumbert, S; Guy, R (2005-04-05). "Physical methods for gene transfer: Improving the kinetics of gene delivery into cells". Advanced Drug Delivery Reviews. 57 (5): 733–753. doi:10.1016/j.addr.2004.12.007. PMID 15757758.
  10. ^ Felgner, P. L.; Gadek, T. R.; Holm, M.; Roman, R.; Chan, H. W.; Wenz, M.; Northrop, J. P.; Ringold, G. M.; Danielsen, M. (1987-11-01). "Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure". Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (21): 7413–7417. doi:10.1073/pnas.84.21.7413. ISSN 0027-8424. PMC 299306. PMID 2823261.
  11. ^ Kingston, Robert E.; Chen, Claudia A.; Rose, John K. (2003). "Calcium Phosphate Transfection". Current Protocols in Molecular Biology. 63 (1): 9.1.1–9.1.11. doi:10.1002/0471142727.mb0901s63. ISSN 1934-3647. PMID 18265332. S2CID 46188175.
  12. ^ Robbins, Paul D.; Ghivizzani, Steven C. (1998). "Viral Vectors for Gene Therapy". Pharmacology & Therapeutics. 80 (1): 35–47. doi:10.1016/S0163-7258(98)00020-5. PMID 9804053.
  13. ^ Shen, Aimee; Lupardus, Patrick J.; Morell, Montse; Ponder, Elizabeth L.; Sadaghiani, A. Masoud; Garcia, K. Christopher; Bogyo, Matthew (2009-12-02). Xu, Wenqing (ed.). "Simplified, Enhanced Protein Purification Using an Inducible, Autoprocessing Enzyme Tag". PLOS ONE. 4 (12): e8119. doi:10.1371/journal.pone.0008119. ISSN 1932-6203. PMC 2780291. PMID 19956581.
  14. ^ Griffiths, Anthony J.F. (2015). Introduction To Genetic Analysis. New York: W.H. Freeman & Company. ISBN 978-1464188046.
  15. ^ Godiska, R.; Wu, C. -C.; Mead, D. A. (2013-01-01), "Genomic Libraries", in Maloy, Stanley; Hughes, Kelly (eds.), Brenner's Encyclopedia of Genetics (Second Edition), San Diego: Academic Press, pp. 306–309, doi:10.1016/b978-0-12-374984-0.00641-0, ISBN 978-0-08-096156-9, retrieved 2020-11-06
  16. ^ Hu, Bo; Khara, Pratick; Christie, Peter J. (2019-07-09). "Structural bases for F plasmid conjugation and F pilus biogenesis in Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (28): 14222–14227. doi:10.1073/pnas.1904428116. ISSN 0027-8424. PMC 6628675. PMID 31239340.
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