전기화학 압타머 기반 바이오센서

Electrochemical aptamer-based biosensors

단일가닥 RNA와 DNA 염기서열인 앱타머는 분석물질과 결합하여 형태를 바꿉니다. 이들은 단백질, 박테리아 세포, 금속 이온 등과 같은 분자를 선택적으로 결합하는 핵산의 기능을 합니다.[1] 앱타머는 원하는 표적에 결합하기 위한 정확한 특이성을 갖도록 개발할 수 있습니다. 압타머는 결합 시 형태를 변경하여 측정할 수 있는 전기화학적 특성을 변경합니다. 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화(SELEX) 프로세스는 압타머를 생성합니다.[2] 전기화학 압타머 기반(E-AB) 바이오센서는 압타머의 전기화학적, 생물학적 특성을 활용하여 실시간, 생체 내 측정을 수행하는 장치입니다.

E-AB[3](Electrochemical Apptamer-based) 바이오센서는 생체 내에서 특정 표적 결합에 반응하여 전기화학적 신호를 생성하는 것을 특징으로 하는 전극을 통과하는 파라다익 전류의 변화에 의해 신호를 측정하는 방법. E-AB 센서는 실시간 측정으로 생체 내 표적 결합을 감지할 수 있는 능력으로 인해 형광 발생 압타머와 같은 이전에 보고된 압타머 기반 센서보다 유리합니다.[4] E-AB 센서는 문의 전극, 기준 전극 및 상대 전극의 3전극 셀로 구성됩니다. 전기 화학 셀 내에서 신호가 생성된 다음 전위차에 의해 측정 및 분석됩니다.[5] 여러 생화학적 및 전기화학적 매개변수는 E-AB 바이오센서에 대한 신호 이득을 최적화합니다. 표적 결합의 신호 대 잡음비뿐만 아니라 신호 이득을 결정하는 요소는 DNA 또는 RNA 앱타머의 밀도 패킹, 포텐시오스타트에 의해 투여되는 ACV 주파수, 자가 조립 단분자층(SAM)의 화학성 등입니다.[3] E-AB 바이오센서는 현장 감지, 피드백 제어 약물 투여 및 암 바이오마커에 대한 유망한 메커니즘을 제공합니다.[4]

왼쪽: 이 이미지는 압타머가 고정된 전극 표면을 표시하고 SAM(Self Assembly Monolayer)은 압타머가 고정되지 않은 표면을 패시베이션합니다. 산화환원 리포터(파란색)는 표적 분자(보라색)가 없을 때 펼쳐진(또는 부분적으로 펼쳐진) DNA 상의 금 전극으로부터 멀리 떨어져 있습니다. 표적 결합 시 DNA는 접힘에 의해 구조를 변화시켜 산화 환원 리포터를 전극 표면에 더 가깝게 만듭니다. 오른쪽: 전류의 변화는 기준선에 대한 신호를 생성합니다. 베이스라인 신호는 타겟 없이 생성된 신호입니다. 베이스라인은 압타머 대 압타머의 산화환원 활성을 나타냅니다. Ag/AgCl.[5]

신호발생

DNA 또는 RNA 앱타머는 문의 전극에 고정되며, 여기서 산화환원 반응은 산화환원 태그에 의해 보고됩니다. 금은 종종 전극을 조사하기 위한 프로브 표면으로 사용됩니다. 금 전극의 표면은 산화환원 태그 DNA 또는 RNA 앱타머로 가득 차 있습니다. 산화 환원 리포터는 종종 메틸렌 블루입니다.[3] 표적 결합 시 압타머는 접힘에 의해 구조를 변경하여 산화 환원 리포터를 금 전극에 더 가깝게 만듭니다. 산화환원-리포터에서 전극으로의 근접성이 증가하면 산화환원 태그에서 금 전극으로의 더 빠른 전자 전달이 가능합니다.[5] 전자 전달 속도의 증가는 포텐셔스탯에 의해 검출되는 파라다이스 전류의 변화에 기여합니다.

기준 전극은 산화 환원 전위가 알려진 알려진 화학 반응의 현장입니다. 예를 들어, 은-염화은(Ag/AgCl)의 반응을 포함하는 기준 전극은 고정된 산화환원 전위를 가지며, 문의 전극의 산화환원 전위의 측정점입니다.[6] 상대 전극(또는 보조 전극)은 문의 전극에 대한 음극 또는 양극 역할을 합니다.[5] 인가된 전압은 전위차에 의해 공급되는 임피던스로 인해 기준 전극을 통과하지 못합니다. 따라서 전기화학 전지 내에서 발생하는 전위는 문의 전극에 기인합니다. 전류는 문의 전극의 전위 대 기준 전극의 고정 전위로 측정됩니다. 전위의 차이는 외부 회로에서 전류를 발생시키고 신호를 발생시키는 것입니다. 이 신호는 표적 결합에 화학량론적으로 비례하는 전자 전달에 따라 표적 결합을 정량화합니다.[5]

압타머가 전극이 아닌 막 위에 그래프팅된 [7]전기화학 나노다공성 알루미나 막 센서에서도 네 가지 전극 방법이 입증되었습니다. 압타머와 타겟 단백질의 결합은 임피던스 분광 분석기를 사용하여 전기화학 센서에 의해 감지되는 막의 임피던스 변화를 생성합니다. 이 접근법은 전극의 전기장이 압타머 구조 또는 생체 인터페이스를 변경하여 감지 능력을 저하시킬 수 있는 경우에 유용할 수 있습니다.

신호최적화

결합 유도 전기화학적 신호 이득의 최적화를 위해 고려해야 할 몇 가지 파라미터가 있습니다. 압타머 프로브 패킹 밀도, 자가 조립 단층의 특성, ACV 주파수는 신호의 검출 및 측정에 영향을 미치는 요소입니다.[3] 프로브 표면의 패킹 밀도를 제작할 때는 크게 두 가지 요소를 고려합니다. 압타머의 농도와 SAM(Self-assembly monolayer)의 표면 화학은 원하는 프로브 패킹 밀도의 변화를 가능하게 합니다.[3]

압타머 패킹 밀도

전극 표면의 압타머 패킹의 밀도는 신호를 최적화하는 데 중요한 파라미터입니다. 표적 분자의 크기와 특성에 따라 다른 압타머 패킹 밀도는 신호 이득을 선호합니다. 연구에 따르면 작은 표적 분자는 저밀도 압타머 패킹에 대해 더 큰 신호 이득을 가능하게 하는 반면 표적으로서 더 큰 단백질은 중간 프로브 패킹 밀도에서 가장 큰 신호를 생성합니다.[3] 입체 장애로 인해 최적의 신호 이득 범위 이상으로 패킹 밀도가 증가함에 따라 신호 이득이 감소합니다. 압타머에 인접한 프로브 표면이 인접한 압타머에 의해 차단되면 표적 결합된 압타머의 산화환원 태그는 전극과 접촉할 공간이 없기 때문에 표적 결합을 보고하지 못합니다. 깨끗한 프로브를 배양하는 용액 내 압타머의 농도는 프로브에 고정되는 압타머의 밀도에 비례하는 것으로 나타났습니다.[3] 코카인 E-AB 센서와 같은 작은 표적이 가장 낮은 프로브 패킹 밀도로 가장 많은 신호를 발생시킨다는 연구 결과가 보고되었습니다. 반대로 단백질 트롬빈과 같은 더 큰 단백질 표적은 중간 프로브 패킹 밀도에서 가장 많은 신호를 생성합니다.[3]

SAM 성질과 표면 화학

연속적으로 프로브는 SAM에서 배양되어 타겟 또는 추가 압타머 결합을 위해 비어 있는 프로브의 표면을 반응성이 없게 만듭니다.[3] 최적화된 SAM 두께는 표면이 표적 결합에 대해 패시베이션될 수 있을 만큼 충분히 두껍고 산화환원 리포터에서 전극으로 전자를 전달할 수 있을 정도로 얇습니다. SAM 두께는 길이로 측정할 수 있습니다. 코카인 E-AB 센서는 SAM이 얇을수록 더 많은 신호를 발생시키고 따라서 전도성이 더 높은 것으로 보고되었습니다. 그러나 SAM을 6개의 탄소에서 2개의 탄소로 줄이면 신호가 감소하고 6개의 탄소 SAM을 사용하여 피크 전류가 발생합니다.[3]

ACV 주파수

ACV 주파수는 타겟 바인딩을 정량화하는 패러데이 전류를 모니터링하는 데 사용됩니다.[3] ACV가 감지 가능한 범위에 있는 한 신호 발생은 ACV 주파수에 둔감하므로 너무 낮지 않거나 너무 빠르기 때문에 감지할 수 없다고 보고되었습니다.[3] ACV 주파수는 전극의 열화를 보호하기 위해 단일 방향 전류 대신 사용됩니다. 구형파 전압전류법을 적용하고 측정하여 전압이 전극 전체에 선형적으로 스윕됨에 따른 전류의 변화를 분석합니다.[8]

압타머 세대

이미지는 압타머 선택을 위한 SELEX 프로세스를 보여줍니다. 핵산 배열은 표적과 함께 배양된 다음, 결합되지 않은 서열을 제거하기 위해 분리됩니다. 결합 서열은 상보적 가닥을 제거하기 위해 증폭 및 정제 과정을 거칩니다.

E-AB 압타머의 설계 및 제작은 이전에 보고된 압타머에 사용된 방법과 일치합니다. SELEX는 뉴클레오티드 앱타머의 제조 및 선택을 위한 잘 알려진 선택 방법입니다. 1990년대에 과학자들은 셀렉스를 소개했습니다. 압타머는 이 과정을 통해 시험관 내 표적 인식을 기반으로 선택됩니다. SELEX에서 압타머는 특정 대상을 인식하는 능력에 따라 선택됩니다. 이 방법에는 세 가지 주요 단계가 포함됩니다. 먼저 단일가닥 핵산이 표적에 결합됩니다. 다음으로 결합된 핵산과 결합되지 않은 핵산을 분리합니다. 마지막으로 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 표적에 대한 친화력을 갖는 핵산을 증폭시켜 추가 스크리닝 또는 기능 분석을 가능하게 합니다. SELEX 이후에는 표적 결합 능력으로[9] 인해 풍부해진 서열을 식별하기 위해 고처리량 시퀀싱이 사용됩니다. SELEX는 단일 라운드에서 달성할 수 있는 농축량에 의해 상대적으로 제한됩니다.[10] 이러한 한계를 극복하는 압타머 제작에 대한 덜 보고된 스크리닝 방법은 파티클 디스플레이(Particle Display)라고 불리는 친화성 기반 라이브러리 농축입니다.[9]

파티클 디스플레이

파티클 디스플레이는 기존의 선택 방법보다 더 적은 라운드에서 더 높은 친화도의 앱타머 수율을 생성합니다.[9] 이 방법에서 압타머의 라이브러리는 압타머 입자로 분리되고 친화도에 기초한 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리됩니다. 가장 친화도가 높은 압타머 입자만 분리되어 압타머로 시퀀싱됩니다.[9] 이것은 SELEX와 같은 선택 방법보다 더 효율적인 친화성-염기 선택 과정입니다. 입자 디스플레이는 타겟 결합의 높은 친화성과 특이성으로 인해 E-AB 센서의 신뢰할 수 있는 압타머 생성 방법이 될 수 있습니다.

연구원들은 기존의 SELEX에서 입자 디스플레이 시스템(PDS)을 도입하여 고친화성 앱타머를 분리하는 문제에 대처했습니다.[9] PDS는 단일클론 압타머 스크리닝을 위해 병렬 단일분자 에멀젼 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 부산물의 증식을 방지하고 희귀한 고친화성 서열을 보존하기 위해 에멀젼 PCR 및 액적 디지털 PCR을 사용합니다. PDS의 단일 입자-1 서열 특성은 DNA-표적 상호작용을 입자-표적 상호작용으로 변환하여 형광 활성화 세포 분류 또는 유세포 분석을 통해 압타머 후보 친화도를 신속하게 확인할 수 있게 합니다. 기존의 SELEX와 달리 PDS는 앱타머를 효율적으로 분리하여 고친화성 바인더를 식별하고 분리하는 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다.[9] PDS는 고친화성 앱타머를 농축하는 효율성을 크게 향상시켜 한 번의 스크리닝에서 이를 달성합니다.

입자 디스플레이는 기존의 선택 방법에 비해 더 적은 라운드에서 더 많은 양의 더 높은 친화성 압타머를 산출합니다. 이 방법은 압타머 라이브러리를 압타머 입자로 분리하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 친화도에 따라 입자를 분리합니다. 가장 친화도가 높은 압타머 입자만 분리되어 압타머로 시퀀싱됩니다. 이러한 친화성 기반의 선택 과정은 SELEX와 같은 방법보다 더 효율적입니다. 입자 디스플레이는 표적 결합의 높은 친화성 및 특이성으로 인해 E-AB 센서에 대한 신뢰할 수 있는 압타머 생성 방법일 수 있습니다.

이점

EAB 센서는 대사, 내분비학, 약동학 및 신경화학에 대한 우리의 이해를 귀중한 연구 도구로 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 특히, 이러한 센서는 약물 전달, 제거 및 대사 항상성 유지와 같은 현상에 대한 향상된 해상도와 보다 정량적인 측정을 제공합니다. 피드백 제어 기능을 갖춘 EAB 센서는 예를 들어 혈장 약물 수준과 후속 임상 또는 행동 반응 사이의 상관 관계를 설명할 수 있는 전례 없는 기회도 제공합니다. 여러 신체 위치에서 EAB 센서에 의해 수행되는 동시 측정은 신체 구획 내 및 신체 구획 간의 약물 및 대사 산물 수송에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 체내 측정을 넘어 EAB 센서는 소규모(예: "칩 위의 장기")에서 산업적 규모(예: 산업적 생물반응기 모니터링)에 이르기까지 세포 배양 응용 분야에서 실시간 모니터링에 유용할 수 있습니다. 그들은 이미 성상세포에서 ATP 방출을 모니터링하고 유리 나노피펫을[11] 사용하여 세포 배양에서 세로토닌을 검출하는 등의 응용 분야에서 유용성을 입증했습니다.

'화학적 항체'로 불리는 압타머는 표적 분자에 대한 특이적 인식과 결합 능력 때문에 치료제와 바이오센싱에 사용됩니다. 이들은 상당히 가볍고, 세포 내 표적에 쉽게 침투하고, 합성적으로 생성될 수 있고, 비면역원성이며, 안정성을[12] 나타내기 때문에 고전적인 항체에 비해 이점을 제공합니다. 앱타머는 단백질을 식별하는 데 탁월하며, 진단 및 치료에서 정확성을 입증하며, 특히 생체 분자 정제, 카이랄 분리 및 생화학적[13] 분석에서 실험실 분석 및 분리에 적용됩니다. 압타머가 구조적 변화를 겪을 수 있는 능력은 항체가 부족한 유연성을 보여주는 담금질 기반 바이오센서를 개발하는 데 이상적입니다.[14] 교차 반응성 및 배치 변형이 발생하기 쉬운 항체와 달리 압타머는 맞춤형 선택성 및 안정성을 제공합니다.[12] 이는 특히 작은 분자와 같은 저분자량 개체를 대상으로 하는 바이오센서 응용 분야에서 잘 드러납니다.

한계

E-AB 센서에서는 전기화학 반응과 타겟 부재 사이의 신호가 작습니다. 압타머는 대규모의 구조적 변화로 재설계될 수 있습니다. 긴 유연한 루프 또는 상보적 가닥은 압타머 형태의 변화를 강제할 수도 있습니다. 압타머를 수정하는 이러한 기술은 신호 비율을 증가시키지만 측정할 수 있을 만큼 충분한지 보장하지는 않습니다.

E-AB 센서는 전개된 압타머만큼만 민감합니다. 압타머의 선택성은 혈액이나 다른 체액에 유사한 화합물이 있을 때 우려가 될 수 있습니다. 교차 react성은 vivo 내 모니터링에 간섭을 일으키고 압타머가 시료에 포함되어 있을 수 있는 유사한 화합물과 어떻게 반응하는지 이해해야 합니다.

유망한 애플리케이션

E-AB 바이오센서는 약물 전달을 제어하기 위한 기반입니다. E-AB 신호 계산을 약물 투여 의료기기에 통합하는 것에 기초한 용량 수준을 갖는 지속적인 약물 투여를 위한 피드백 제어 약물 전달 방법.[4] E-AB 바이오센서는 시약이 필요 없고, 항체 검출 방법에 비해 가격이 저렴하며,[15] 비표적 분자가 풍부한 혈액이나 다른 유체에 사용할 수 있고, 재사용이 가능합니다. 이는 모두 E-AB 바이오센서를 컴퓨터 프로그래밍의 통합 계산에 의존하는 피드백 제어 약물 전달의 유망한 방법으로 만드는 요소입니다.[4]

연구 응용프로그램

EAB 센서는 대사, 내분비학, 약동학 및 신경화학에 대한 우리의 이해를 귀중한 연구 도구로 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 특히, 이러한 센서는 약물 전달, 제거 및 대사 항상성 유지와 같은 현상에 대한 향상된 해상도와 보다 정량적인 측정을 제공합니다.[16] E-AB 센서는 피드백 제어 능력으로 인해 예를 들어 혈장 약물 수준과 후속 임상 또는 행동 반응 사이의 상관 관계를 설명할 수 있는 전례 없는 기회도 제공합니다. 여러 신체 위치에서 E-AB 센서에 의해 수행되는 동시 측정은 신체 구획 내 및 신체 구획 간의 약물 및 대사 산물 수송에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.[16] 체내 측정을 넘어 E-AB 센서는 소규모(예: "칩 위의 장기")에서 산업적 규모(예: 산업적 생물반응기 모니터링)에 이르기까지 세포 배양 응용 분야에서 실시간 모니터링에 유용할 수 있습니다. 그들은 이미 성상세포에서 ATP 방출을 모니터링하고 유리 나노피펫을 사용하여 세포 배양에서 세로토닌을 검출하는 등의 응용 분야에서 유용성을 입증했습니다.[17][18]

임상 적용

E-AB 센서는 환자의 건강을 실시간으로 모니터링하는 웨어러블 기기에 적응할 수 있습니다. E-AB 센서는 초기 단계에서 질병을 감지하는 데 도움이 될 수 있는 특정 바이오마커를 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어, C-반응 단백질의 측정은 웨어러블 기기의 심장마비를 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다.[16]

E-AB 센서는 복잡한 생체 내 환경에서 분자를 모니터링할 수 있는 획기적인 가능성을 제공하며 임상 환경에서 변형적인 응용을 제공합니다. 지속적인 포도당 모니터에 필적하는 E-AB 감지 플랫폼의 웨어러블 디바이스로의 통합을 구상하는 것은 건강과 질병을 반영하는 약물 및 바이오마커의 실시간 측정에 대한 가능성을 가지고 있습니다. 특히, 간질 피부 영역에서 E-AB 센서를 탐색하는 것은 이와 관련하여[19] 가능성을 보여줍니다.

패혈증이 의심되는 경우, C-반응 단백질과 같은 감염 바이오마커의 모니터링은 질병 예후 및 중증도에[20] 대한 중요한 통찰력을 제공하는 잠재적인 생명을 구하는 접근법으로 두드러집니다. 마찬가지로, 심장 위험이 높은 개인의 경우, 편리한 웨어러블 디바이스의 배치는 트로포닌과 같은 특정 바이오마커의 심장 사건의[21] 시작과 연관성을 고려하여 심장마비의 조기 발견을 용이하게 할 수 있습니다. 복잡한 샘플 매트릭스 내에서 실시간으로 특정 단백질의 피코몰 농도를 측정하는 E-AB 센서의 탁월한 기능은 플랫폼을 이러한 임상 모니터링 애플리케이션에 적합한 도구로 포지셔닝합니다.

E-AB 센서는 질병 감지를 넘어 특히 정밀 의학 분야에서 약물 투여 관행을 혁신할 것이라는 약속을 담고 있습니다. 평균적인 개인의 약물 흡수와 반응에 대한 가정에 기반을 둔 일반적인 약물 투여 접근법은 환자 변동성에 비해 치료 창구가 좁은 약물에는 미치지 못합니다.[16] 느리고 빈번하지 않은 채혈에 의존하거나 관찰 가능한 부작용을 기다리는 현재의 투여 방법론은 과소 투여 또는 과다 투여의 잠재적 위험을 수반합니다.[16] 혈장 약물 수준에 대한 실시간 통찰력을 제공하는 기능을 가진 E-AB 센서는 개선된 치료 약물 모니터링을 통해 약물 치료의 안전성과 효능을 크게 향상시킬 수 있는 길을 제시합니다.

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