G리스 카세트

G-less cassette

G-less 카세트 전사 어세이(Gless cassette transcription assay)는 분자생물학에서 시험관내 프로모터 강도를 측정하기 위해 사용되는 방법이다.이 기술은 플라스미드를 [1]사용한 mRNA 제품의 정량화를 포함한다.G-less 카세트는 사전 구성된 벡터의 일부로, 일반적으로 카세트의 업스트림에 다중 복제 사이트(MCS)를 포함합니다.이러한 이유로 관심 있는 프로모터를 MCS에 직접 삽입하여 최종적으로 프로모터가 전사 기계를 모집할 때의 정확성과 효율성을 측정할 수 있습니다.

프로모터가 복제되어
G-less 카세트 플라스미드
(a) 365 nt의 G-less 센스 스트랜드를 가진 프리메이드 플라스미드를 프로모터 삽입한다.(b) 프로모터를 전사 개시부위 바로 상류에 있는 다중 클로닝부위(MCS)로 클로닝한다.중합효소는 G리스 카세트를 전사한다.카세트가 전사되고 카세트 너머의 센스 스트랜드에서 첫 번째 구아노신 삼인산이 검출되면 전사가 조기에 종료된다.방사선 라벨이 부착된 365nt의 트랜스크립트가 공개된다.G-less 카세트 검사에서 생성된 전사물은 겔 전기영동을 통해 길이를 확인하고 자동 방사선 촬영을 통해 상대적 프로모터 강도를 확인할 수 있습니다.

방법

G-less 카세트는 구아닌 뉴클레오티드가 결여된 트랜스크립트를 DNA의 감각 가닥에 코드하는 리포터 유전자이다(따라서 "G-less").[2]그러한 유전자를 포함한 플라스미드는 MCS의 하류에 위치한다.프로모터가 MCS에 삽입된 후 전사는 방사성 라벨이 부착된 UTP, CTP 및 ATP(및 비방사성 라벨/콜드 뉴클레오티드)의 첨가로 진행되며 G-less 카세트의 끝에 도달하여 다시 한 번 구아닌 잔기가 se에 나타날 때까지 계속된다.DNA의 nse 가닥.시험관내 GTP의 부재는 카세트에 이은 감각 가닥의 첫 번째 구아닌 잔기에서 전사가 조기에 종료되는 결과를 초래한다.전사 생성물에 대해 겔 전기영동을 실시하고, 방사능량을 오토라디오그래피 또는 형광 이미징으로 정량하여 관심 프로모터의 강도를 결정한다.

어플

G-less 카세트 기술은 기본적인 전사 수준을 초과하는 프로모터 강도를 결정하는 데 사용됩니다(즉, 전사 활성제 또는 전사[3] 인자가 있는 경우).예를 들어 TFIID의 존재 하에서 사카로미세스 세레비시아에 있는 TATA 박스 컨센서스 배열 변경의 영향을 측정하기 위해 [4]각 프로모터의 상대적 강도를 측정하기 위해 G-less 카세트를 구현했다.

이점

G-less 검사는 원형 플라스미드에서 수행하여 전사 수준을 측정할 수 있습니다.원형 플라스미드는 결절이 필요한 유출 전사 등 다른 측정법에 비해 많은 시스템에서 보다 효율적인 템플릿을 제공합니다.이 방법은 다른 간접 mRNA 제품 측정을 수행하는 불필요한 프로세스를 우회하기 때문에 매우 효율적으로 방사선 라벨이 부착된 트랜스크립트를 생성합니다.프로모터는 G-less 카세트를 포함하는 원형 플라스미드에 삽입되며, 플라스미드 전체에 걸쳐 무작위 및 비특이적 전사를 생략하는 특정 길이의 전사를 생성합니다.Hela 핵 추출물과 같은 대부분의 조잡한 시스템은 백그라운드 전사를 초래하는 오염 GTP를 적게 포함하고 때때로 G-less [5]카세트를 통해 무작위 전사를 일으킬 수 있기 때문에 사용된다.

레퍼런스

  1. ^ Park, JH; Magan, N (2014-11-12). "Reverse Transcriptase-Coupled Quantitative Real Time PCR Analysis of Cell-Free Transcription on the Chromatin-Assembled p21 Promoter". PLOS ONE. 6 (8): e23617. doi:10.1371/journal.pone.0023617. PMC 3160311. PMID 21886803.
  2. ^ Aria Baniahmad (2002). Thyroid Hormone Receptors: Methods and Protocols. Springer Science & Business Media. p. 211. ISBN 978-1-59259-174-9.
  3. ^ Kazerouninia, A; Ngo, B; Martinson, HG (2014-11-12). "Poly(A) signal-dependent degradation of unprocessed nascent transcripts accompanies poly(A) signal-dependent transcriptional pausing in vitro". RNA. 16 (1): 197–210. doi:10.1261/rna.1622010. PMC 2802029. PMID 19926725.
  4. ^ Bjornsdottir, G; Myers, LC (2014-11-12). "Minimal components of the RNA polymerase II transcription apparatus determine the consensus TATA box". Nucleic Acids Res. 36 (9): 2906–16. doi:10.1093/nar/gkn130. PMC 2396422. PMID 18385157.
  5. ^ Carey, MF; Peterson, CL; Smale, ST (2014-11-12). "G-less cassette in vitro transcription using HeLa cell nuclear extracts". Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3): pdb.prot5387. doi:10.1101/pdb.prot5387. PMID 20194456.