키네틱 제외 검사

Kinetic exclusion assay
그림 1.용액에서 리간드에 결합되지 않은 수용체 분율은 리간드 코팅 고형상에 의해 포착되고 이후 형광 이차 항체로 라벨이 표시된다.

키네틱 배제 분석(KinExA)은 수용체, 리간드, 수용체 리간드 복합체를 함유한 용액이 고체상 고정된 추가 리간드에 잠깐 노출되는 바이오 어세이 유형이다.[1][2]

설명

검사 중에 자유 수용체의 일부분은 고체상 리간드에 의해 포착되고 그 후에 형광 2차 분자로 라벨이 붙는다(그림 1).[1][2]고체 단계와의 접촉 시간이 짧다고 해서 해결책에서 미리 형성된 콤플렉스가 크게 분리되는 것은 아니다.[3]따라서 용액 분리는 포획된 수용체에 기여하는 것에서 "기생적으로 배제"되며, 그 결과 신호는 용액 내 자유 수용체에 대한 측정치를 제공한다.

일련의 평형화된 용액에서 자유수용체를 총 리간드의 함수로 측정하면 평형분리 상수(Kd)를 계산할 수 있다.[1][2][3][4][5][6][7]평형 전 몇 개의 점으로 자유수용체를 측정하면 연관률 상수(kon)를 측정할 수 있다.오프 레이트(koff)도 직접 측정할 수 있지만, 일반적으로 측정된 K와d 측정된 kon, (koffd = K * kon)에서 계산된다.

운동 제외 측정은 나노극에서 대퇴막까지의 범위에서 K를d 측정하기 위해 사용되어 왔다.[4][5][6][7]

적용들

그림 2.신호 생성의 예1) Beads Load. 2) 평형화된 용액이 column을 통과한다.3) 2차 라벨의 도입4) 포획된 자유 수용체의 형광 방출

형광 이차 분자는 용액으로부터 자유 수용체를 포획한 후에 적용되기 때문에(그림 2) 운동 배제 측정을 사용하여 측정한 결합 상수는 수정되지 않은 분자에 대한 것이므로 수정이 필요한 방법(일반적으로 라벨링 또는 이모빌)보다 내생적 결합 상호작용을 더 정확하게 반영한다.측정 전에 [1][2]이즈레이션)운동 배제 측정은 세럼에서 [4][5]정화되지 않은 분자를 사용하여 수행되었으며,[7] 측정된 결합 상호작용을 내생성 상태에 더 가깝게 하는 온전한 세포의[8][9] 세포막 단백질에 대한 결합을 측정했다.

KinExA의 측정에 적합한 분자는 항체,[4][7][10][11][12] 재조합 단백질,[13][14][15] 작은 분자,[6][16][17][18] 압타머,[19][20] 지질,[21][22] 나노베이드,[23] 독소 등이다.[10][24][25]

최대 이론적 Kd 제한 민감도를 제공할 수 있는 것으로 입증된 농도 면역측정에도 운동 제외 검사가 적용되었다.[26][27]이 기술의 예는 환경 오염물질의 민감한 검출에 거의 실시간으로 적용되었다.[28]

표준 평형 친화도 분석

일련의 샘플은 동일한 수용체(R) 농도로 준비되지만 리간드(L) 농도를 적정화하는 방식으로 준비된다.평형에 도달한 후 각 표본을 기둥을 통해 흐르게 하여 측정한다(그림 2).

1:1 가역 결합의 경우 평형 Kd는 다음과 같이 정의된다.

(1) Kd≡koff/kon =R*L/RL

바인딩은 되돌릴 수 있으므로 질량 보존은 다음과 같이 기록될 수 있다.

(2T) R = R+RL

(3T) L = L +RL

위치:

Kd = 평형 분리 상수

kon = 전진 속도 상수

koff = 역률 상수

R = 평형 상태에서 자유 수용체 현장 농도

L = 평형 상태에서 자유 리간드 현장 농도

RL = 평형상태에서 복합체의 농도

RT= 수용체 총농도

LT = 리간드의 총농도

K와d L에 대한T R(=R/RT)의 자유분수와 관련된 간단한 방정식은[1][2] 측정된 데이터에 적합하여 교호작용의d K를 찾는다.

요율상수분석

속도 상수를 측정하기 위해 알려진 수용체와 리간드의 농도를 용액에 혼합하고 용액 위상 반응이 일어나면서 자유 수용체의 양을 시간 경과에 따라 반복적으로 측정한다.자유 수용체 고갈의 시간 코스는 표준 분자 속도 방정식으로 적합하다.

(4) dLR/dt = kon∙R∙L - Kd∙kon∙RL

여기서d K * k는on k로off 대체되었다.

참조

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