RNA 무결성 수

RNA integrity number

RIN(RNA 무결성 번호)은 RNA 측정에 무결성 값을 할당하기 위한 알고리즘입니다.

RNA의 무결성은 유전자 발현 연구의 주요 관심사이며,[1] 전통적으로 일관성이 없는 것으로 판명된 방법인 28S에서 18S의 rRNA 비율을 사용하여 평가되어 왔다.28S와 18S 겔 이미지를 비교하려면 주관적인 인체 해석이 필요하기 때문에 이러한 불일치가 발생합니다.이 문제를 극복하기 위해 RIN 알고리즘이 고안되었습니다.RIN 알고리즘은 일반적으로 캐피럴리 겔 전기영동을 사용하여 얻은 전기영동 RNA 측정에 적용되며, 보다 보편적인 측정을 제공하기 위해 RNA 무결성에 대한 정보를 제공하는 다양한 특징의 조합을 기반으로 합니다.RIN은 다른 RNA 무결성 계산 알고리즘과 비교한 연구에서 견고하고 재현 가능한 것으로 입증되어 분석 [2]대상 RNA의 품질을 결정하는 바람직한 방법으로서의 위치를 확고히 하고 있다.

RIN에 대한 주요 비판은 식물과 함께 사용하거나 진핵세포와 원핵세포의 상호작용에 대한 연구에서 사용하는 것이다.RIN 알고리즘은 진핵생물/원핵생물/염소플라스틱 리보솜 RNA를 분화할 수 없으며, 그러한 상황에서 심각한 품질 지수 과소 평가를 생성한다.

용어.

전기영동은 핵산 종에 전장을 가함으로써 핵산 종에 길이를 기준으로 분리하는 과정이다.핵산은 음전하를 띠면서 매트릭스(일반적으로 아가로스겔)를 통해 전기장에 의해 밀리고, 작은 분자는 더 멀리,[3] 더 빠르게 밀립니다.모세관 전기영동은 매우 얇은 튜브 안에 있는 겔 위에서 소량의 핵산 샘플을 실행할 수 있는 기술이다.기계에는 핵산 검체가 튜브의 특정 지점을 통과하는 시기를 알 수 있는 검출기가 있으며, 작은 검체가 먼저 통과합니다.이로 인해 그림 1과 같은 전자영웅그램이 생성될 수 있다. 여기서 길이는 샘플이 검출기를 통과하는 시간과 관련이 있다.

마커는 나머지 샘플의 실제 크기를 알 수 있도록 샘플과 함께 실행되는 알려진 크기의 샘플입니다. 나머지 샘플의 실행 거리/시간을 이 마커와 비교함으로써 실제 크기를 알 수 있습니다.

RNA는 모든 살아있는 세포에서 많은 중요한 역할을 하는 당과 질소 염기로 만들어진 생물학적 고분자이다.RNA에는 몇 가지 하위 유형이 있으며, 세포에서 가장 두드러지는 것은 tRNA(전달 RNA), rRNA(리보솜 RNA), mRNA(메신저 RNA)이다.이 3종 모두 번역과정에 관여하고 있으며 세포 RNA의 가장 현저한 종(~85%)은 rRNA이며, 이는 RNA를 전기영동으로 분석했을 때 가장 즉시 볼 수 있는 종으로 RNA의 품질을 결정하는 데 사용된다(아래 연산 참조).rRNA는 크기가 다양하며 포유류는 5S, 18S, 28S 사이즈에 속합니다.28S 및 5S rRNA는 큰 서브유닛을 형성하고 18S는 단백질 [4]합성을 담당하는 분자 기계인 리보솜의 작은 서브유닛을 형성한다.

적용들

RNase는 어디에나 존재하며 종종 실험실에서 RNA 샘플을 오염시키고 분해할 수 있기 때문에 RNA 무결성이 매우 쉽게 훼손될 수 있으며,[5][6] 그 영향을 제거하도록 설계된 여러 실험실 기술로 이어집니다.그러나, 이러한 방법들은 어리석지 않으며, 따라서 샘플은 여전히 분해될 수 있으며, 분자 분석의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 RNA 무결성을 측정하는 방법이 필요하다. 왜냐하면 RNA 무결성은 마이크로 어레이 분석, Northern Blots 또는 정량적 실시간과 같은 유전자 발현 연구에서 적절한 결과에 매우 중요하기 때문이다.PCR(qPCR)[7][8]분해된 RNA는 계산된 발현 수준에 직접적인 영향을 미치며, 종종 겉으로 보이는 [9]발현을 현저하게 감소시킵니다.

qPCR과 유사한 기술은 시간과 비용이 많이 들기 때문에 유전자 발현 및 기타 [10]응용에 대한 qPCR의 정확성과 재현성을 유지하면서 비용을 줄이기 위한 지속적인 연구가 수행되고 있다.RIN 평가는 과학자들이 유전자 발현 연구를 수행하는 데 상당한 비용이 들기 전에 실험의 신뢰성과 재현성을 평가할 수 있게 해준다.

RIN은 RNA 무결성을 측정하는 표준 방법이며 새로운 RNA 분리 [11]기술로 생성된 RNA의 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

발전

RNA 무결성은 분자생물학 연구에서 오랫동안 문제로 알려져 왔기 때문에, 역사적으로 RNA의 무결성을 결정하기 위해 사용되어 온 몇 가지 방법들이 있다.가장 인기 있는 것은 브롬화 에티듐 염색을 사용한 아가로스겔 전기영동법이며, 이는 rRNA 피크에서 밴드를 시각화할 수 있게 해준다.28S 및 18S 대역의 높이는 서로 비교할 수 있으며, 2:1의 비율로 분해되지 않은 [1]RNA를 나타냅니다.이 방법은 매우 저렴하고 쉽지만, 이 방법에는 주로 주관성 등 몇 가지 문제가 있으며, 일관성이 없고 표준화되지 않은 RNA 품질 평가가 필요하며,[1][12] 작업할 RNA가 많지 않으면 문제가 될 수 있습니다.또한 낮은 부하, 불균일한 실행, 불균일한 염색 등 Agarose 겔 전기영동으로 인해 발생할 수 있는 여러 가지 문제가 있으며, [13]이는 RNA 무결성을 결정하기 위해 Agarose 겔 전기영동을 사용하는 정확도의 변동성을 증가시킵니다.

RNA 무결성 번호는 애질런트테크놀로지스가[citation needed] 개발했습니다.이 알고리즘은 수백 개의 샘플을 추출하여 전문가가 무결성에 따라 1~10의 값을 수동으로 할당함으로써 생성되었으며, 10이 가장 높은 값입니다.베이지안 학습 기술을 사용한 적응 학습 도구는 주로 "계산"[1][14] 아래에 나열된 기능을 사용하여 RIN을 예측할 수 있는 알고리즘을 생성하기 위해 사용되었습니다.따라서 모든 애질런트 소프트웨어가 특정 RNA 샘플에 대해 동일한 RIN을 생산하여 측정을 표준화하고 이전[citation needed] 방법보다 주관적이지 않습니다.

계산

그림 1약 10의 RIN을 갖는 이상적인 일렉트로 히어로그램 트레이스.오른쪽은 세포 RNA 샘플을 실행하면 아가로스 겔의 한 레인에서 고갈되는 것처럼 보이는 예입니다.왼쪽은 이러한 겔에 의해 생성될 수 있는 전자영웅그램 트레이스의 라벨이 부착된 이상형 버전입니다.실제 전기영웅그램에서는 특히 mRNA에 대응하는 고속 영역에 많은 작은 피크가 있지만 명확성을 위해 포함되지 않았다.
그림 2약 1 또는 2의 RIN을 갖는 이상적인 일렉트로 히어로그램 트레이스.28S 및 18S 피크가 매우 큰 그림 1과 달리 여기서는 피크가 축소되어 샘플의 대부분이 원래 마커 위치에 가까운 왼쪽에 있습니다.RNA의 평균 크기가 확연히 줄어들어 RNA의 질이 떨어지는 것으로 나타났다.

샘플의 RIN은 RNA Electropherogram 트레이스의 몇 가지 특성을 사용하여 계산되며, 아래에 나열된 처음 두 가지가 가장 중요합니다.RIN은 1 ~10의 값을 전기영웅그램에 할당합니다.10은 열화가 가장 적은 값입니다.다른 종의 RNA는 rRNA [1]크기가 다르기 때문에 포유류의 RNA에는 다음과 같은 설명이 모두 적용됩니다.총 RNA 비율은 그래프 아래의 총 면적 대비 18S 및 28S rRNA 피크 아래의 면적 비율을 취함으로써 계산되며, 여기서 큰 수치가 바람직하며, 이는 rRNA의 많은 부분이 여전히 이러한 크기이므로 열화가 거의 발생하지 않았음을 나타낸다.이상적인 비율은 그림 1에서 볼 수 있으며, 대부분의 RNA는 18S 및 28S RNA 피크에 있습니다.

28S peak의 높이는 큰 값이 바람직하며, 일반적으로 18S rRNA보다 분해 속도가 빠르기 때문에 RIN 계산에 가장 현저한 rRNA 종인 28S가 사용되므로 피크 높이를 측정하면 분해 초기 단계의 검출이 가능하다.다시 그림 1에 나타나 있듯이 28S 피크가 가장 크므로 이는 양호한 결과입니다.

고속 영역은 전기영웅그램에서 18S와 5S rRNA 피크 사이의 영역입니다.처음에는 빠른 면적비 값이 증가함에 따라 18S 및 28S rRNA가 중간 크기로 분해되는 것을 나타내지만 RNA가 더 분해될수록 더 작은 크기로 감소한다.따라서 값이 낮다고 해서 반드시 RNA 무결성이 좋거나 나쁘다는 의미는 아닙니다.

소량의 RNA만 분해되어 짧은 마커로 표시되는 가장 작은 길이로 진행되었음을 나타내는 작은 마커 높이가 바람직합니다.여기서 다량의 rRNA가 발견되면 이 마커에 가까운 작은 조각으로 분해된 것입니다.이 상황은 그림 2에서 볼 수 있는 '저품질' RNA 전기영웅그램에서 볼 수 있으며, 마커에 대한 피크 높이(맨 왼쪽)가 매우 크기 때문에 RNA가 크게 저하되었습니다.원핵 샘플의 경우 알고리즘이 다소 다르지만 Agilent 2100 Bio Analyzer Expert 소프트웨어는 현재 [15]원핵 샘플의 RIN도 계산할 수 있습니다.이러한 차이는 포유동물 표본이 우세한 종으로 28S와 18S 리보솜 RNA를 가지고 있는 반면, 원핵생물 RNA는 크기가 23S와 16S로 약간 더 작기 때문에 이를 수용하기 위해 알고리즘을 변경해야 한다는 사실에서 발생할 수 있다.원핵생물 RNA 무결성 수치를 계산하는 데 있어 또 다른 중요한 사실은 RIN이 진핵생물 RNA에 [15]대해 가지고 있는 정도로 검증되지 않았다는 것이다.RIN 값이 높을수록 진핵생물에서는 더 나은 다운스트림 결과와 상관관계가 있는 것으로 나타났지만, 이것은 원핵생물에서는 그렇게 광범위하게 행해지지 않았기 때문에 원핵생물에서는 덜 의미할지도 모른다.

이러한 RIN 계산을 위한 전기영웅프로그램은 전기영동을 수행하고 전기영웅프로그램을 [14]생성할 수 있는 Agilent Bio Analyzer 기계를 사용하여 수행됩니다.애질런트 2100 소프트웨어는 정확한 알고리즘이 독점적이기 때문에 RIN 소프트웨어를 고유하게 수행할 수 있으므로 계산에 사용되는 중요한 RNA Electropherogram 기능이 공개적으로 제공되지 않습니다.

레퍼런스

  1. ^ a b c d e Schroeder, Andreas; Mueller, Odilo; Stocker, Susanne; Salowsky, Ruediger; Leiber, Michael; Gassmann, Marcus; Lightfoot, Samar; Menzel, Wolfram; Granzow, Martin; Ragg, Thomas (2006). "The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements". BMC Molecular Biology. 7 (1): 3. doi:10.1186/1471-2199-7-3. PMC 1413964. PMID 16448564.
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외부 링크