역보체 중합효소 연쇄반응

Reverse complement polymerase chain reaction

역상보 중합효소 연쇄반응(RC-PCR)은 중합효소 연쇄반응(PCR)의 변형이다.주로 차세대 염기서열결정(NGS)에 의한 DNA 염기서열결정(DNA)을 위한 앰플리콘 라이브러리를 생성하는 데 사용됩니다.이 기술은 증폭과 단일 폐쇄 튜브 반응에서 생성된 앰피콘의 양 끝에 독립적으로 시퀀스 또는 기능 영역을 추가할 수 있는 능력을 모두 허용합니다.RC-PCR은 2013년 영국 솔즈베리 NHS Foundation Trust의 Daniel Ward와 Christopher Mattocks에 의해 발명되었습니다.

원칙

범용 프라이머와 RC 프로브의 상호작용을 표현하여 기능적인 타깃 고유의 프라이머를 생성합니다.범용 프라이머는 RC 프로브와 교배하여 표적 특이 프라이머를 생성하는 DNA 중합효소에 의해 확장됩니다.RC 프로브의 5개 주요 부분에는 원하는 대상 특정 프라이머 시퀀스의 역보완 시퀀스가 포함되어 있습니다.


RC-PCR에서는 반응 혼합물에 표적 특이 프라이머가 존재하지 않는다.대신 반응이 진행됨에 따라 표적 특이 프라이머가 형성됩니다.이 방법을 사용하는 일반적인 반응은 4개의 올리고뉴클레오티드를 필요로 한다.올리고뉴클레오티드는 쌍으로 상호 작용한다; 하나의 올리고뉴클레오티드 프로브와 하나의 범용 프라이머(선택된 기능 도메인을 포함)는 그들의 3' 말단에서 서로 교배한다.일단 하이브리드화되면 올리고뉴클레오티드 프로브를 템플릿으로 사용하여 범용 프라이머를 확장하여 완전히 형성된 표적 특정 프라이머를 생성할 수 있으며, 표준 PCR 반응에 따라 후속적인 열 사이클링 라운드에서 템플릿을 증폭시킬 수 있다.

올리고뉴클레오티드 프로브는 또한 프로브의 등가 확장을 방지하기 위해 3' 말단에서 차단될 수 있지만, 이는 필수적이지 않다.프로브는 소모되지 않으며, 연속적인 PCR 사이클을 통해 범용 프라이머가 대상 특정 프라이머로 '전환'되는 템플릿 역할을 할 수 있습니다.이 타깃 특정 프라이머 생성은 표준 PCR 조건에서 표준 PCR 증폭과 병렬로 발생합니다.


Illumina 차세대 시퀀싱에 의한 다운스트림 분석을 위한 앰플리콘 라이브러리를 생성하기 위한 일반적인 멀티플렉스 RC-PCR의 표현.단일 폐쇄 튜브 반응으로 여러 표적이 증폭되고 이중 지수화됩니다.타깃 특정 프라이머 생성은 1차 및 후속 라운드에서 발생하며 타깃 증폭 및 엠프리콘 생성은 2차 및 후속 열 사이클링에서 발생합니다.


이점

표준 PCR 반응과 비교한 RC-PCR 반응의 상대 반응 성분의 도식적 표현.

RC-PCR은 다른 엠프리콘 라이브러리 준비 방법보다 큰 이점을 제공합니다.가장 중요한 것은 단일 폐쇄 튜브 반응으로, 이는 다른 2단계 PCR 접근법과 관련된 교차 오염을 제거할 뿐만 아니라 시약을 덜 사용하고 수행에 더 적은 노동력을 필요로 한다.

이 기술은 또한 원하는 시퀀스 또는 기능 영역을 앰피콘의 양 끝에 추가하는 유연성의 상당한 이점을 제공합니다.이는 현재 단일 타깃 특정 프로브 쌍을 범용 프라이머 라이브러리와 함께 사용할 수 있는 최신 차세대 시퀀싱(NGS) 실험실에서 가장 유리합니다.이 장점은 NGS 어플리케이션과 함께 샘플 고유의 인덱스를 앰피콘 구조의 양 끝에 독립적으로 적용하기 위해 사용됩니다.이 접근방식을 사용하는 실험실은 단일 인덱스 프라이머 세트만 필요로 하며, 이 인덱스 세트와 호환되는 모든 표적 특정 프로브와 함께 사용할 수 있다.이는 전장 사전 동기화된 표적 특이적 프라이머를 사용하는 것에 비해 실험실에서 요구하는 올리고뉴클레오티드의 수와 길이를 유의하게 감소시킨다.

반응 진행에 따라 표적 특정 프라이머가 생성되어 반응 구성요소의 균형이 더욱 강화됩니다.표적특이프라이머의 농도는 표적분자 농도와 보다 일치하여 표적프라이머와 프라이머 이합체 양쪽의 가능성을 감소시킨다.

바리에이션

  • 다중 RC-PCR – 반응 혼합물에 두 개 이상의 범용 프라이머 프로브 세트가 있어 두 개 이상의 대상을 동시에 증폭합니다.
  • RT-RC-PCR – 이 수정은 반응으로 공급된 템플릿 재료가 DNA가 아닌 RNA일 때 사용됩니다.이 변형에서 반응 혼합물은 또한 역전사효소 효소와 역전사 프라이머뿐만 아니라 방법의 범용 프라이머 및 역보체 프로브도 포함한다.이 접근방식은 제공된 RNA 템플릿의 역전사, 꼬리 있는 표적 특정 프라이머의 형성 및 단일 폐쇄 튜브 반응에서 원하는 표적 증폭을 허용합니다.
  • 싱글 엔드 RC-PCR – 이 방법의 변형은 하나의 표적 특정 프라이머를 생성하기 위한 반응에서 하나의 보완적인 범용 프라이머 프로브 쌍만 제공될 때 사용됩니다.다른 대상별 프라이머는 표준 PCR에 따라 기존 프라이머로 제공됩니다.

역사

2013년 RC-PCR의 발명에 따라, 이 기술은 임상적으로 검증되었으며, WRGL(Wesex Regional Genetics Laboratory)의 골수증식성 종양과 급성 골수성 백혈병을 포함한 체질적으로 후천적인 질환뿐만 아니라 혈전증, 혈전증 등 유전 질환의 범위에 대해 진단적으로도 적용되었다.Alisbury UK.보다 최근에는 SARS-CoV-2 [1]대유행과의 싸움에서 이 기술을 활용하기 위한 작업이 수행되고 있다.

이 특허출원은 2015년 영국에서 이루어졌으며 2020년에 수여되었다.특허출원은 전 세계 다른 관할구역에서 이루어지고 있으며 현재 출원 중이다.

2019년 5월 Nimagen B.V.[2]는 이 기술을 활용한 키트 개발, 제조 및 마케팅을 위한 지적재산을 허가받았다.현재 시판되고 있는 키트에는 사람 식별용[3][4] 키트, 최근에는 변종 식별 및 추적을[5] 위한 SARS-CoV-2 바이러스의 전체 게놈 시퀀싱용 키트 등이 있습니다.

레퍼런스

  1. ^ Mattocks, Christopher; Ward, Daniel; Mackay, Deborah (2021-03-05). "RT-RC-PCR: a novel and highly scalable next-generation sequencing method for simultaneous detection of SARS-COV-2 and typing variants of concern". medRxiv: 2021.03.02.21252704. doi:10.1101/2021.03.02.21252704. S2CID 232119608.
  2. ^ "NimaGen Licenses PCR Tech From Salisbury NHS Foundation Trust". Genomeweb. 2019-01-14. Retrieved 2021-04-22.
  3. ^ Kieser, Rachel E.; Buś, Magdalena M.; King, Jonathan L.; van der Vliet, Walter; Theelen, Joop; Budowle, Bruce (January 2020). "Reverse Complement PCR: A novel one-step PCR system for typing highly degraded DNA for human identification". Forensic Science International. Genetics. 44: 102201. doi:10.1016/j.fsigen.2019.102201. ISSN 1878-0326. PMID 31786458. S2CID 208535138.
  4. ^ Bus, Magdalena M; de Jong, Erik AC; King, Jonathan L; der Vliet, Walter van; Theelen, Joop; Budowle, Bruce (2021-08-05). "Reverse complement-PCR, an innovative and effective method for multiplexing forensically relevant single nucleotide polymorphism marker systems". BioTechniques. 71 (3): btn–2021–0031. doi:10.2144/btn-2021-0031. ISSN 0736-6205. PMID 34350776.
  5. ^ Wolters, Femke; Coolen, Jordy P. M.; Tostmann, Alma; Groningen, Lenneke F. J. van; Bleeker-Rovers, Chantal P.; Tan, Edward C. T. H.; Geest-Blankert, Nannet van der; Hautvast, Jeannine L. A.; Hopman, Joost; Wertheim, Heiman F. L.; Rahamat-Langendoen, Janette C. (2020-10-29). "Novel SARS-CoV-2 Whole-genome sequencing technique using Reverse Complement PCR enables fast and accurate outbreak analysis". bioRxiv: 2020.10.29.360578. doi:10.1101/2020.10.29.360578. S2CID 226228646.

외부 링크