역상 단백질 리세이트 마이크로 어레이

Reverse phase protein lysate microarray

역상 단백질 리세이트 마이크로어레이(RMA)는 양질의 항체가 있을 때 다량의 생물 검체에서 단백질 발현 수준을 정량적으로 동시에 측정할 수 있도록 도트블롯 플랫폼으로 설계된 단백질 마이크로어레이다.[1]null

기술적으로 손상되지 않았는데 세포로부터(를)휴대 lysates, 또는 레이저 포획microdissected 세포, 시럼, CSF, 오줌, 초자체, 침, 등과 같이(b)신체의 체액의 작은 양은 그 때 단일 특이 항체로 표적 단백질의 많은 샘플을 가로질러 표현을 발견할 수 있는 용액은 마이크로 어레이에 개인이 있는 곳에서 활동하고 있다.[2]RPA의 요약 비디오를 이용할 수 있다.[3]하나의 마이크로 배열은 설계에 따라 일련의 반복실험으로 인쇄되는 수백에서 수천 개의 표본을 수용할 수 있다.검출은 1차 또는 2차 표지의 항체를 화학적 발광, 형광 또는 색도 검사에 의해 수행된다.그런 다음 배열은 이미징되고 얻은 데이터는 정량화된다.null

멀티플렉싱은 서로 다른 항체를 가진 동일한 라이세이트로 점철된 복수의 배열을 동시에 프로빙하여 이루어지며, 정량적으로 보정된 검사로 구현할 수 있다.[4]또한 RPMA는 전세포 또는 미분해 또는 미세분열 세포 라이스를 활용할 수 있기 때문에 다른 고투과 기술로 접근할 수 없는 후번역 변형 단백질에 관한 직접 계량 가능한 정보를 제공할 수 있다.[5][6]따라서 RPMA는 높은 처리량, 민감성 및 정량적 방법으로 고차원 단백질 데이터를 제공한다.[5]그러나 ELISA, 즉 면역항체화학 등의 다른 기법에서 볼 수 있듯이 RPMA에 의해 생성된 신호는 특정되지 않은 1차 항체 또는 2차 항체 결합에서 생성될 수 있으므로, 단일 지점으로부터의 신호는 교차 반응성에 기인할 수 있다.따라서, RPMA에 사용된 항체는 반드시 서부 블록에 의한 세포 라이스에 대한 특수성과 성능에 대해 신중하게 검증되어야 한다.[1][7]null

RPMA는 암세포의 단백질 발현에 대한 정량적 분석, 바이오마커 프로파일링을 위한 체액 또는 조직, 세포 신호 분석 및 임상 예후, 진단 또는 치료 예측 등 다양한 용도를 가지고 있다.[1]이것은 한 실험에서 단백질 표지자 수준의 상대적 또는 절대적 풍부성 또는 차등 발현을 위해 한 명 또는 많은 환자의 다양한 장기로부터 다른 질병 단계의 미세 분열된 조직 생체실험을 가진 Lysate와 레이저 캡쳐로 구성될 수 있기 때문에 가능하다.또한 다양한 자극이나 여러 시점에서 약물의 용량에 반응하여 단백질 역학을 감시하는 데도 사용된다.[1]RPMA가 단백질 신호 경로 탐색 및 매핑, 분자 약물 표적 평가 및 후보 약물의 작용 메커니즘 이해 등을 위해 사용되는 다른 애플리케이션도 있다.[8]또한 치료적 의사결정을 촉진하거나 지도하기 위해 암환자의 잠재적인 조기 스크린 테스트로 제안되었다.null

다른 단백질 마이크로레이로는 전방 단백질 마이크로레이(PMA)와 항체 마이크로레이(AMA)가 있다.PMAs는 항체와 다른 작은 화합물에 의해 가려진 미세 배열의 정제된 그리고 때로는 변성된 재조합 단백질을 고정시킨다.AMAs는 마이크로 어레이에 적용된 샘플에서 분석 물질을 포착하는 항체를 고정시킨다.[4][6]대상 단백질은 직접 라벨링 또는 분석 대상 단백질(샌드위치 접근법)의 다른 표피에 대한 2차 표식 항체에 의해 검출된다.PMA와 AMA 모두 분석물질을 포착하기 위한 미끼의 고정화가 수반되기 때문에 전방 위상 배열로 분류할 수 있다.전방 위상 배열에서 각 배열은 세포 리세이트나 환자의 혈청 같은 하나의 테스트 샘플로 인큐베이팅되지만 샘플의 여러 분석 물질은 동시에 테스트된다.[4]그림 1은 분자 수준에서 전방(여기서 항체를 미끼로 사용)과 역상 단백질 미세배열을 보여준다.null

실험 설계 및 절차

RPMA는 연구 질문이나 연구의 유형과 목적에 따라 배열의 내용, 표본 수, 마이크로 플레이트 내의 표본 배치, 배열 배치, 마이크로 어레이의 유형, 정확한 검출 항체, 신호 검출 방법, 검체의 품질 관리 등을 선택하여 설계할 수 있다.그런 다음 실제 실험을 실험실에서 설정하고 얻은 결과를 정량화하여 분석한다.실험 단계는 아래에 열거되어 있다.

시료채취

세포는 T-25 플라스크에서 37도, 적절한 매질에서 5%의 CO2로 자란다.[1]연구의 설계에 따라, 세포가 혼합된 후, 그들은 약물로 치료될 수 있고, 성장 인수로 치료될 수 있으며, 혹은 그들은 투석 단계 전에 조사될 수 있다.시간 과정 연구의 경우, 자극제가 플라스크 집합에 동시에 첨가되고 플라스크는 다른 시점에서 처리된다.[1]약물 투여량 연구의 경우 일련의 플라스크를 다른 용량으로 처리하고 모든 플라스크를 동시에 수집한다.[1]null

조직/s의 세포분수 리세이트를 포함하는 RPMA를 만드는 경우 레이저 캡쳐 마이크로 단면(LCM) 또는 미세 바늘 흡인 방법을 사용하여 특정 세포를 조직 영역에서 현미경으로 격리한다.[4][8]null

세포투석

위의 방법 중 하나를 통해 수집된 세포의 펠릿은 세포 용해 완충제로 라이스를 처리하여 고단백 농도를 얻는다.[1]null

항체 검사

리사이트의 지혈은 2차원 단차선 SDS-PAGE에 의해 풀링되고 해결되며 니트로셀룰로오스 막에 서부 블롯팅이 뒤따른다.이 막은 4mm 스트립으로 자르고, 각 스트립은 다른 항체로 조사된다.단일 밴드가 있는 스트립은 RPMA 사용에 적합한 특정 항체를 나타낸다.항체 성능도 RPMA에 대한 실제 샘플 채취 전에 동일한 조건에서 더 작은 샘플 크기로 검증해야 한다.[1][7]

RPMA 시공

색도측정 기법을 사용할 경우 세포 라이스를 수집하여 6~10회 연속 희석하거나, 형광 검출이 사용될 때 희석하지 않는다(색도 검출보다 형광의 동적 범위가 크기 때문에).그런 다음 연속 희석액을 384- 또는 1536-웰 마이크로티터 플레이트로 반복 도금한다.[1]그런 다음 오션 바이오시스템 2470 또는 플렉시스 로봇(Genomic 솔루션)과 같은 마이크로 어레이에 의해 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인 코팅 유리 슬라이드에 리세이트를 인쇄한다.[1][9]고체핀 시스템을 갖춘 아우숀 2470은 점성이 매우 강한 라이스를 가진 어레이 생산에 사용할 수 있고 습도 환경 제어와 자동화된 슬라이드 공급 시스템을 갖추고 있어 이상적인 선택이다.[1]그렇기는 하지만, Array Microarray Printing Pins도 사용할 수 있고, 리세이트를 덜 사용하여 처리량이 훨씬 높은 마이크로레이를 생산할 수 있다는 것을 보여주는 논문들이 출판되고 있다.[10]멤브레인 코팅 유리 슬라이드는 Schleicher와 Schuell Bioscience(현재 GE Whatman www.whatman.com 소유),[9] Grace BioLabs(www.gracebio.com), 써모 사이언티픽, SHOTT Nexterion(www.schott.com/nexterion) 등 여러 기업에서 상업적으로 구입할 수 있다.[11]null

면역화학 신호 검출

슬라이드가 인쇄된 후 어레이의 비특정 결합 부위는 I-Block과 같은 차단 완충제를 사용하여 차단되며, 어레이는 1차 항체 및 2차 항체로 검사된다.검출은 보통 다코사이톰(DakoCytomation) 촉매 신호 증폭(CSA) 시스템으로 실시한다.신호 증폭을 위해 슬라이드를 스트렙타비딘-바이오틴-페록시디아제 콤플렉스에 이어 바이오티닐-티라미드/과산화수소, 스트렙타비딘-페록시디아제를 배양한다.과산화수소를 이용한 개발이 완료되고, 슬라이드의 스캔이 (1)을 획득한다.Tyramide 신호 증폭은 다음과 같이 작동한다: 고정된 고추냉이 과산화수소가 존재하는 상태에서 Tyramide를 반응성 중간으로 변환한다.활성화된 티라미드는 활성 HRP 효소가 결합되는 부위와 가까운 인접 단백질에 결합한다.이것은 현장에 더 많은 티라미드 분자 침적으로 이어진다; 따라서 신호 증폭.[12][13]null

랜스 리오타와 엠마뉴알 페트리코인은 2001년 RPMA 기법을 발명(아래 역사 섹션 참조)[14]했으며, 근적외선 형광 기법을 이용한 멀티플렉스 검출 방법을 개발했다.이 연구에서 그들은 배열당 관측된 엔드포인트의 수를 효과적으로 두 배로 늘릴 수 있는 이중 염료 기반 접근법을 사용하여 예를 들어 인광 특이적 수준과 총 단백질 수준을 한 번에 측정 및 분석할 수 있다고 보고한다.null

데이터 정량화 및 분석

일단 면역 체계가 수행되면 단백질 발현을 계량화해야 한다.신호 수준은 색도 검출 기법을 사용할 경우[1] 일반 광학 평판 스캐너의 반사 모드를 사용하거나 형광 기법을 사용할 경우 TECAN LS 시스템과 같은 레이저 스캔을 통해 얻을 수 있다.그런 다음 온라인에서 사용할 수 있는 두 개의 프로그램(P-SCAN 및 단백질스캔)을 사용하여 스캔한 이미지를 숫자 값으로 변환할 수 있다.[1]이러한 프로그램은 각 지점의 신호 강도를 정량화하고 선량 보간 알고리즘(DI25)을 사용하여 각 샘플에 대해 정규화된 단일 단백질 표현 수준 값을 계산한다.각 샘플 간의 총 단백질 농도 차이를 감안하고, 항체 얼룩이 샘플 간에 직접 비교될 수 있도록 정상화가 필요하다.[15]이것은 콜로이드 골드 총 단백질 착색 또는 Sypro Ruby 총 단백질 착색에 의해 총 단백질이 착색되는 실험을 병행함으로써 얻을 수 있다.[1]여러 개의 RPMA를 분석할 때 신호 강도 값을 열 지도로 표시할 수 있어 베이시안 클러스터링 분석 및 신호 경로 프로파일링이 가능하다.[15]RPMA를 위해 고안된 최적의 소프트웨어 툴은 Vigene Tech, Inc.에 의해 Microvigene이라고 불린다.

힘

RPMA의 가장 큰 강점은 매우 적은 수의 입력 물질에서 단백질의 높은 처리량과 멀티플렉스, 초민감 감지를 허용한다는 것이다. 이는 기존의 Western Blotting 또는 ELISA로는 할 수 없는 업적이다.[1][9]마이크로 어레이의 작은 스폿 크기는 직경이 85~200마이크로미터에 이르며, 한 실험에서 동일한 항체를 가진 수천 개의 샘플을 분석할 수 있다.[9]RPMA는 민감도를 증가시켰고 피코그램 범위의 단백질을 검출할 수 있다.[9]일부 연구자들은 심지어 Attogram 범위에서 단백질이 검출되었다고 보고했다.[9]이는 미세그램의 단백질(6)이 필요한 ELISA의 단백질 검출에 비해 크게 개선된 것이다.RPMA의 감도 증가는 배열의 축소형식으로 인해 신호 밀도(신호 강도/면적)[9]가 증가하여 타이라마이드 증착 가능 강화가 이루어지기 때문이다.RPMA의 높은 민감도는 생체검사 샘플과 같은 매우 적은 양의 시작물질로부터 저농도 단백질이나 인지질 신호 단백질과 같은 바이오마커의 탐지를 가능하게 하는데, 이는 보통 조직으로 오염되는 경우가 많다.[4]레이저 캡쳐 마이크로 단면 리세이트를 사용하면 10개 세포에서 분석될 수 있으며,[4] 각 점에는 단백질과 동등한 세포가 100분의 1도 안 된다.null

전통적인 전방 위상 단백질 배열보다 RPMA가 크게 개선된 것은 단백질을 검출하는 데 필요한 항체 수의 감소다.전진상 단백질 배열은 일반적으로 샌드위치 방법을 사용하여 원하는 단백질을 포착하고 검출한다.[4][15]이는 특정 항체가 이용 가능한 단백질에 2개의 상피(단백질을 포획하기 위한 상피 하나와 단백질을 검출하기 위한 상피 하나)가 있어야 함을 의미한다.[15]다른 전방 위상 단백질 마이크로아레이는 시료에 직접 라벨을 붙이지만, 다른 단백질에 대한 라벨링 효율성이 변동하는 경우가 많고, 라벨링으로 인해 항체가 결합되는 상피질이 파괴되는 경우가 많다.[15]이 문제는 샘플에 직접 라벨을 붙일 필요가 없기 때문에 RPMA에 의해 극복된다.null

전방 위상 단백질 마이크로레이와 서부 블로팅에 대한 RPMA의 또 다른 강점은 결과의 통일성이다. 왜냐하면 칩의 모든 샘플은 동일한 1차 항체와 2차 항체 그리고 동일한 농도의 증폭 시약으로 동일한 시간 동안 조사되기 때문이다.[9]이를 통해 모든 표본에 걸쳐 단백질 수준의 차이를 계량할 수 있다.또한 각 샘플을 직렬 희석(색도계) 칩에 인쇄하면 검사의 선형 동적 범위에서만 분석이 수행되도록 내부 제어 기능을 제공한다.[4]최적으로, 동일한 칩에 직접 캘리브레이터와 높은 제어장치와 낮은 제어장치의 인쇄는 각 단백질을 시간 경과에 따라 그리고 실험 사이에 정량적으로 측정할 수 있는 탁월한 능력을 제공할 것이다.조직 미세조영과 부딪히는 문제는 항원 탐색과 면역항생화학 고유의 주관성이다.항체, 특히 인광 특이 시약은 단백질의 3차원 순응으로 인해 가려질 수 있는 선형 펩타이드 시퀀스를 검출하는 경우가 많다.[15]이 문제는 RPMA를 통해 극복된다. 샘플은 변성될 수 있기 때문에 숨겨져 있는 모든 표피들을 드러낼 수 있기 때문이다.[15]null

약점

RPMA의 가장 큰 한계는 모든 면역체계의 경우와 마찬가지로 단백질 탐지를 위한 항체에 대한 의존이다.현재 분석 가능한 신호를 주는 항체가 존재하는 신호 단백질의 수는 제한적이지만 빠르게 증가하고 있다.[15]또한 적절한 항체를 찾으려면 RPMA 분석을 시작하기 전에 서구적 블로킹에 의해 많은 항체를 광범위하게 검사해야 할 수 있다.[1]이 문제를 극복하기 위해 두 개의 오픈 리소스 데이터베이스가 생성되어 예상 범위 내에서 결합 특수성이 양호한 항체에 대해 Western Blot 결과를 표시하였다.[1][16][17]더욱이, RPMA는 서양의 블롯과 달리 분자량으로 단백질 분율을 해결하지 않는다.[1]따라서 선행 항체 유효성 검사를 수행하는 것이 중요하다.null

역사

RPMA는 2001년 랜스 리오타와 이매뉴얼 페트리코인이 이 기술을 발명한 논문에서 처음 소개되었다.[8]저자들은 이 기법을 이용해 역사학적으로 정상적인 전립선 상피세포의 레이저 캡쳐 미세분해, 전립선 내피세포 신소화증, 환자 일치 침습성 전립선암 등을 이용해 현미경 전환 단계에서 프로생존 체크포인트 단백질의 상태를 성공적으로 분석하였다.[8]그 이후로 RPMA는 많은 기초 생물학, 번역 및 임상 연구에 사용되어 왔다.게다가, 이 기술은 이제 처음으로 임상 실험에 도입되었는데, 전이성 대장암과 유방암을 가진 환자들을 RPMA의 결과에 따라 치료 대상으로 선택했다.이 기법은 테라노스틱스 헬스 주식회사가 개인 맞춤형 의약 기반 애플리케이션을 위해 상용화되었다.

참조

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외부 링크