레깅에 의한 시퀀싱

레깅에 의한 염기서열은 DNA 염기서열에서 주어진 위치에 존재하는 뉴클레오티드를 식별하기 위해 효소 DNA 리기아제를 사용하는 DNA 염기서열방식이다. 현재 대부분의 인기 있는 DNA 염기서열 분석법과 달리, 이 방법은 두 번째 가닥을 만들기 위해 DNA 중합효소를 사용하지 않는다. 대신 대상 DNA 분자의 염기서열을 결정하는 데 DNA 리가아제 효소의 불일치 민감도가 사용된다.

과정

DNA 리기아제는 DNA 분자의 끝을 결합하는 효소다. 일반적으로 제한 효소 조각의 결합에서와 같이 두 쌍의 끝단을 한꺼번에 결합하는 것으로 표현되지만, 리가제는 두 가닥 중 한 가닥에만 끝단을 결합할 수 있다(예를 들어, 다른 가닥이 이미 연속적이거나 결함에 필요한 단자 인산염이 부족한 경우). DNA 리가아제는 DNA 구조에 민감하며 두 가닥의 염기 사이에 불일치가 있을 때 효율성이 매우 낮다.

레깅에 의한 염기서열은 염기서열 불일치에 대한 DNA 리가제의 민감도에 의존한다. 염기서열 분석 대상 분자는 알려지지 않은 DNA 염기서열의 한 가닥이며, 적어도 한쪽 끝에는 알려진 염기서열이 붙어 있다. 알려진 순서를 묶기 위해 짧은 "앵커" 가닥이 들어온다.

그런 다음 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼합 풀(길이 8~9 베이스)을 가져와 시퀀싱할 위치에 따라 라벨(일반적으로 형광 염료)을 부착한다. 이들 분자는 대상 DNA 염기서열 옆에 교배하며, 그 염기서열이 알 수 없는 DNA 염기서열과 일치하면 DNA 리가 분자를 우선 닻에 결합시킨다. 분자가 생성하는 형광에 기초하여 알 수 없는 순서에서 이 위치에서 뉴클레오티드의 정체를 유추할 수 있다.

또한 올리고뉴클레오티드 탐침은 라벨을 식별한 후 절단할 수 있는 갈라진 연결로 구성될 수 있다. 이렇게 하면 라벨이 제거되고 연결된 프로브 끝에 5' 인산염이 재생되어 시스템이 다른 한 라운드의 레깅을 준비할 수 있다. 이 사이클은 긴 시퀀스를 읽기 위해 여러 번 반복될 수 있다.^[1] 이것은 N번째 베이스마다 시퀀스되는데, 여기서 N은 갈라진 후 남은 프로브의 길이다. 건너뛴 위치의 순서를 정하기 위해 닻과 묶인 올리고뉴클레오티드는 대상 DNA 시퀀스를 벗겨낼 수 있으며, 하나 이상의 베이스가 짧은 앵커로 시작하는 레깅에 의한 또 다른 한 번의 시퀀싱이 시작될 수 있다.

더 간단하지만, 더 제한적이기는 하지만, 라벨이 프로브의 다른 위치에 해당하는 단일 레깅을 반복해서 한 바퀴 돌고, 이어 앵커와 묶인 프로브를 탈취하는 것이다.^[2][3]

라벨에 의해 차단되는 프로브 올리고뉴클레오티드의 어느 쪽 끝에 따라 레깅에 의한 시퀀싱이 어느 방향(5'-3' 또는 3'-5')으로 진행될 수 있다. 3'-5' 방향은 여러 사이클의 레깅을 할 때 더 효율적이다. 이는 폴리머아제 기반 시퀀싱 방법과 반대 방향이라는 점에 유의하십시오.

제한 사항

이 배관법에 의한 염기서열은 팔린드로믹 시퀀스 시퀀스에 문제가 있는 것으로 보고되었다.^[4]

참고 항목

• 하이브리드화에 의한 시퀀싱
• 2 기본 인코딩
• ABI 솔리드 시퀀싱

참조