단일 분자 실시간 시퀀스 처리

Single-molecule real-time sequencing

단일분자실시간(SMRT) 염기서열은 병렬화된 단일분자 DNA 염기서열법이다.단일 분자 실시간 시퀀싱은 제로 모드 도파관(ZMW)[1]을 사용합니다.단일 DNA 중합효소 1분자를 템플릿으로 ZMW 바닥에 부착한다.ZMW는 DNA 중합효소에 의해 통합된 DNA의 단일 뉴클레오티드만 관찰할 수 있을 정도로 작은 조명 관찰량을 만드는 구조이다.4개의 DNA 염기는 각각 4개의 다른 형광 염료 중 하나에 부착되어 있다.DNA 중합효소에 의해 뉴클레오티드가 통합되면 형광 태그는 분해되어 형광이 더 이상 관찰되지 않는 ZMW의 관찰 영역 밖으로 확산됩니다.검출기는 뉴클레오티드 혼입의 형광신호를 검출하고 [2]염료의 대응하는 형광에 따라 염기 호출을 실시한다.

테크놀로지

DNA 배열은 많은 ZMW를 포함하는 칩에서 수행됩니다.각 ZMW 내에는 단일 가닥 DNA 템플릿 분자를 가진 단일 활성 DNA 중합효소가 바닥에 고정되고, 이를 통해 빛이 침투하여 단일 분자 수준에서 DNA 중합효소의 활성을 감시할 수 있는 가시화 챔버를 형성한다.DNA 중합효소에 의해 통합된 포스포 연결 뉴클레오티드의 신호는 DNA 합성이 진행됨에 따라 검출되며, 이는 실시간으로 DNA 염기서열 분석을 일으킨다.

템플릿 준비

라이브러리를 준비하기 위해, 헤어핀 어댑터 [3]결합을 사용하여 DNA 조각들을 원형으로 만듭니다.

포스포링크뉴클레오티드

각 뉴클레오티드 염기에는 검출기가 DNA 합성을 수행할 때 DNA 중합효소에 의해 포함된 염기를 식별할 수 있는 대응하는 형광색소 분자가 있다.형광 염료 분자는 뉴클레오티드의 인산염 사슬에 부착됩니다.DNA 중합효소에 의해 뉴클레오티드가 통합될 때 형광색소는 DNA 사슬을 연장하기 위해 포스포디에스터 결합이 생성되는 자연 DNA 합성 과정의 일부로서 인산염 사슬과 함께 분리된다.그러면 분해된 형광 염료 분자가 검출 부피 밖으로 확산되어 형광 신호가 더 이상 [4]검출되지 않습니다.

제로 모드 도파관

제로모드 도파관(ZMW)은 투명한 실리카 [5]기판에 퇴적된 알루미늄 피복막의 원형 구멍으로 구성된 나노포토닉 구속 구조입니다.

ZMW 구멍은 직경 70nm, 깊이 100nm까지입니다.빛이 작은 구멍을 통과할 때의 동작으로 인해,[6][7] 광학장은 챔버 내부에서 기하급수적으로 감소합니다.

조명된 ZMW 내의 관측 부피는 ~20 ZEPTL(20 X 10L−21)입니다.이 부피 내에서 단일 뉴클레오티드를 함유한 DNA 중합효소의 활성을 쉽게 [4][8]검출할 수 있다.

시퀀싱 퍼포먼스

시퀀싱 성능은 실험당 읽기 길이, 정확도 및 총 처리량으로 측정할 수 있습니다.ZMW를 사용하는 PacBio 시퀀스 시스템은 오류율이 5~15% 정도이고 샘플 처리량이 Illumina 시퀀스 [9]플랫폼보다 낮지만 읽기 길이가 길다는 장점이 있습니다.

2018년 9월 19일, Pac Biosciences [Pac Bio]는 화학 버전과 소프트웨어 버전을 동기화한 Sequel 6.0 화학 버전을 출시했습니다.성능은 고분자량 DNA를 가진 대형 삽입 라이브러리와 길이가 약 15,000개 미만인 짧은 삽입 라이브러리의 대조를 보인다.템플릿이 큰 경우 평균 읽기 길이는 최대 30,000개입니다.짧은 삽입 라이브러리의 경우, 같은 분자를 원으로 읽을 때 평균 판독 길이는 최대 100,000개입니다.후자의 짧은 삽입 라이브러리는 단일 SMRT [10]셀로부터 최대 500억 개의 베이스를 산출합니다.

역사

Pacific Biosciences(PacBio)는 2010년 [12]말 RS 기기의 베타 버전을 출시한 후 2011년 [11]SMRT 시퀀싱을 상용화했다.

RS 및 RS II

RS 또는 RS II 시퀀서용 SMRT 셀

상용화 당시 판독 길이는 평균 약 1100베이스의 정규 분포를 가지고 있었다.2012년 초에 출시된 새로운 화학 키트는 시퀀서의 판독 길이를 늘렸습니다. 화학 제품의 초기 고객은 평균 판독 길이를 2500~[13]2900 base로 언급했습니다.

2012년 말에 출시된 XL 화학 키트는 평균 읽기 길이를 4300개 [14][15]이상으로 늘렸습니다.

2013년 8월 21일, PacBio는 새로운 DNA 중합효소 결합 키트 P4를 출시했습니다.이 P4 효소는 C2 염기서열 화학과 짝을 이룰 때 평균 판독 길이가 4,300 염기가 넘고 XL [16]화학과 짝을 이룰 때 5,000 염기가 넘습니다.효소의 정확도는 C2와 비슷하며, 30배와 40배 사이의 QV50에 도달합니다.그 결과, P4 어트리뷰트에 의해서, SMRT 셀을 적게 사용하고, 배리언트 [16]콜을 개량한 고품질의 어셈블리가 실현되었습니다.입력 DNA 크기 선택과 결합하면(BluePippin과 같은 전기영동 기구를 사용), [17]7kbase 이상의 평균 읽기 길이를 산출합니다.

2013년 10월 3일, PacBio는 P5 DNA 중합효소인 P5 화학(P5-C3) PacBio RS II용 새로운 시약 조합을 출시했습니다.이를 합치면 시퀀싱 읽기 길이가 평균 약 8,500개까지 확장되며, 가장 긴 읽기는 30,000개 [18]이상입니다.SMRT 셀당 throughput은 CHM1 [19]셀라인의 시퀀싱 결과에 의해 약 5억 베이스입니다.

2014년 10월 15일, PacBio는 자사의 6세대 중합효소 및 4세대 화학을 대표하는 RS II 시스템용 새로운 화학 P6-C4를 출시했으며, 평균 읽기 길이를 10,000~15,000 베이스로 더 늘렸으며, 가장 긴 판독치는 40,000 베이시스를 초과했습니다.새로운 화학을 사용한 처리량은 염기서열 [20][21]분석 중인 샘플에 따라 SMRT 셀당 5억~10억 베이스가 될 것으로 예상되었습니다.이것은 RS 기구용으로 출시된 화학의 최종 버전입니다.

이 기술에 대한 실험당 throughput은 배열된 DNA 분자의 읽기 길이와 SMRT 셀의 전체 다중의 영향을 받습니다.SMRT 셀의 프로토타입에는 병렬화된 DNA 염기서열 분석을 가능하게 하는 약 3000개의 ZMW 구멍이 포함되어 있습니다.상용화 당시 SMRT 셀은 각각 75,[22]000개의 2세트로 판독된 150,000개의 ZMW 홀을 패턴화했습니다.2013년 4월에는 150,000개의 ZMW 홀을 모두 동시에 사용하는 새로운 버전의 시퀀서 'PacBio RS II'를 출시하여 [23][24]실험당 처리량을 두 배로 늘렸습니다.2013년 11월 최고 스루풋 모드에서는 P5 바인딩, C3 화학, BluePippin 크기 선택, PacBio RS II가 SMRT Cell당 평균 5억 베이스로 공개된 인체 de novo 데이터 세트에도 불구하고 공식적으로 SMRT Cell당 3억 5천만 베이스가 산출되었습니다.throughput은 [25]시퀀싱되는 샘플의 유형에 따라 달라집니다.P6-C4 화학의 도입으로 SMRT 셀당 일반적인 throughput은 5억 베이스에서 10억 베이스로 증가했습니다.

RS 퍼포먼스
C1 C2 P4-XL P5-C3 P6-C4
평균 읽기 길이 기준 1100 2500 - 2900 4300 - 5000 8500 10,000 - 15,000
SMRT 셀당 스루풋 3000만~40만 60M~100M 250M~300M 350~500M 500M~1B

속편

속편 시퀀서용 SMRT 셀

2015년 9월에는 100만 ZMW [26][27]홀까지 용량을 늘린 새로운 시퀀싱 장치인 Sequel System의 출시를 발표했습니다.

Sequel 계측기를 사용하면 초기 판독 길이가 RS와 비슷했고, 이후 화학 제품이 판독 길이를 늘렸습니다.

2017년 1월 23일, V2 케미가 출시되었습니다.이것은 평균 읽기 길이를 10,000~18,000 [28]베이스로 늘렸습니다.

2018년 3월 8일 2.1 케미스트리가 출시되었습니다.평균 읽기 길이를 20,000 베이스로 늘렸고, 전체 읽기 중 절반이 30,000 베이스 이상으로 늘렸습니다.SMRT 셀당 수율은 대형 삽입 라이브러리 또는 짧은 삽입 라이브러리(예: 엠프리콘)에 대해 각각 [29]100억 또는 200억 베이스로 증가했습니다.

8M SMRT 셀의 피펫 팁

2018년 9월 19일, 이 회사는 평균 읽기 길이가 짧은 삽입 라이브러리의 경우 100,000개, 긴 삽입 라이브러리의 경우 30,000개로 늘어난 Sequel 6.0 화학 버전을 발표했습니다.SMRT 셀의 수율은 짧은 [10]삽입 라이브러리의 경우 최대 500억 베이스를 증가시켰습니다.

속편 퍼포먼스
V2 2.1 6.0
평균 읽기 길이 기준 10,000 - 18,000 20,000 - 30,000 30,000 - 100,000
SMRT 셀당 스루풋 5B - 8B 10B ~ 20B 20B~50B

8M 칩

2019년 4월에는 800만 [30]ZMW의 새로운 SMRT Cell을 출시하여 SMRT Cell당 처리량을 8배 [31]증가시켰습니다.2019년 3월 얼리 액세스 고객은 58개 이상의 고객 실행 셀에 약 15KB 길이의 템플릿이 있는 셀당 250GB의 원시 수율, 더 무거운 [32]분자의 템플릿이 있는 셀당 67.4GB의 처리량을 보고했습니다.시스템 퍼포먼스는 고분자 연속 롱 읽기 또는 사전 보정된 HiFi 읽기(CCS(Circular Consensence Sequence)로 보고됩니다.고분자량 판독의 경우 전체 판독치의 약 절반이 50KB보다 깁니다.

속편 II 고분자 중량 퍼포먼스
얼리 액세스 1.0 2.0
SMRT 셀당 스루풋 최대 67.4 GB 최대 160 GB 최대 200 GB

HiFi 성능에는 보정을 위해 반복되는 앰피콘 패스를 사용하여 Pred 점수 Q20 이상의 품질을 가진 보정된 베이스가 포함됩니다.앰피콘의 길이는 최대 20kb입니다.

Sequel II HiFi 수정 읽기 성능
얼리 액세스 1.0 2.0
SMRT 셀당 원시 읽기 수 최대 250 GB 최대 360 GB 최대 500 GB
SMRT 셀별 수정 읽기 수(> Q20) 최대 25 GB 최대 36 GB 최대 50 GB

어플

단일 분자 실시간 시퀀싱은 광범위한 유전체 연구에 적용할 수 있습니다.

de novo 게놈 배열은 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종단에 기초한 생어 배열법에서 읽은 길이와 동등하거나 그 이상이다.읽기 길이가 길기 때문에 de novo 게놈 시퀀싱과 게놈 [2][33][34]조립이 쉬워집니다.과학자들은 또한 짧은 판독 시퀀스 데이터와 긴 판독 시퀀스 데이터를 [35][36]결합하기 위해 de novo 게놈을 위한 단일 분자 실시간 염기서열 분석을 하이브리드 어셈블리에서 사용하고 있습니다.2012년에는 박테리아 [37][38]게놈의 자동 마무리를 증명하는 여러 동료 리뷰가 발표되었습니다.이 중에는 긴 SMRT 시퀀싱 [39]판독을 사용하여 게놈 마무리를 위한 파이프라인을 Celera Assembler에 업데이트한 논문도 포함되어 있습니다.2013년, 과학자들은 오랫동안 읽혀온 염기서열 분석을 통해 대부분의 박테리아와 고고학 [40]게놈을 완전히 조립하고 완성할 수 있을 것으로 추정했다.

원형 DNA 템플릿을 만들고 새로 합성된 DNA 가닥을 [41]템플릿에서 분리하는 가닥 치환 효소를 사용함으로써 동일한 DNA 분자를 독립적으로 다시 배열할 수 있다.2012년 8월, Broad Institute의 과학자들은 SNP [42]호출을 위한 SMRT 시퀀싱의 평가를 발표했습니다.

중합효소의 역학은 염기가 [43]메틸화되었는지 여부를 나타낼 수 있다.과학자들은 메틸화 및 기타 염기변형을 [44][45][46]검출하기 위해 단일 분자 실시간 염기서열을 사용하는 것을 시연했다.2012년에 과학자 팀은 SMRT 염기서열 분석을 사용하여 6개의 [47]박테리아로 이루어진 완전한 메틸롬을 생성했다.2012년 11월, 과학자들은 [48]대장균의 발생 변종의 게놈 전체에 걸친 메틸화에 대한 보고서를 발표했다.

긴 판독은 5'와 3' 말단을 포함한 완전한 유전자 동소형식의 배열을 가능하게 한다.이 유형의 시퀀싱은 Isoforms 및 스플라이스 [49][50]변형을 캡처하는 데 유용합니다.

SMRT 시퀀싱은 부모의 생식선 모자이크가 의심되는 가족을 조사할 때 생식 의학 유전학 연구에 몇 가지 응용이 있다.긴 판독은 돌연변이의 부모 기원을 조사하기 위해 환자에게 하플로타입 페이징을 가능하게 한다.딥 시퀀싱은 정자 세포에서 대립 유전자 빈도를 결정할 수 있게 하며, 향후 영향을 받는 [51][52]자손의 재발 위험 추정에 대한 관련성을 결정할 수 있게 한다.

레퍼런스

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