공간대역학

Spatial transcriptomics

공간적 기록학(spatial transcriptomics)은 (mRNA 판독값으로 식별되는) 셀 유형을 역사학 섹션의 위치에 할당하기 위해 설계된 다양한 방법의 중요한 용어다.이 방법은 또한 mRNA 분자의 세포하 국소화를 결정하는 데 사용될 수 있다.이 용어는 2000년 도일 등이 처음 설명한 공간 유전체학의 변형이며, 이후 2016년에 개발된 기법으로[2] Stål 등이 확장한 것으로, 이후 다양한 개선과 수정을 거쳤다.[2]

Ståhl 방법은[2] 올리고(dT) 꼬리로 mRNA를 캡처할 수 있는 공간 바코드 역사 프리머의 배열 위에 개별 조직 샘플을 배치하는 것을 의미한다.[2]배열된 슬라이드의 x와 y 위치를 나타내는 올리고(dT) 꼬리와 공간 바코드 외에도 프로브에는 갈라진 부위, 증폭 및 염기서열 핸들, 고유 분자 식별자가 들어 있다.[2]흔히 역사학적 샘플은 극저온을 이용해 잘라낸 다음 고정하고, 착색한 후 미세 광선에 붙인다.[2]그 후, 분자가 슬라이드까지 확산될 수 있도록 효소 투과성을 거치게 되며, mRNA가 추가로 방출되고 프로브에 결합된다.[2]그런 다음 현장에서 역전을 수행한다.[2]그 결과, 공간적으로 표시된 보완 DNA가 합성되어, 샘플의 정확한 위치에서 유전자 발현에 관한 정보를 제공한다.[2]따라서 기술된 프로토콜은 동일한 샘플의 병렬 연결된 시퀀싱과 얼룩을 결합한다.[2]배열된 슬라이드 1세대는 지름 100μm의 점 1,000여 점을 구성하여 분해능을 지점당 약 10-40세포로 제한하였음을 언급하는 것이 중요하다.[2]

이 용어의 넓은 의미에서는, 공간적 대본체학에는 대본의 공간적 분배를 해결하기 위한 5가지 주요[3] 접근방식으로 나눌 수 있는 방법이 포함되어 있다.그것들은 미세분해 기술, 상황혼합법, 상황순서, 상황포착 프로토콜, 실리코 접근법에서의 형광이다.[3]

적용

mRNA 분자의 공간 분포를 정의하면 실험자가 조직, 종양, 면역 세포에서 세포 이질성을 발견할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 조건에서 대본의 세포 이질 분포를 결정할 수 있다.[3]이 정보는 조직과 개별 세포 모두에서 세포와 세포 이하의 구조를 모두 해독할 수 있는 독특한 기회를 제공한다.이러한 방법론은 발생학, 종양학, 면역학 및 조직학 분야에서 중요한 통찰력을 제공한다.[3]다세포 유기체에서 개별 세포의 기능은 신체의 정확한 위치를 식별하는 맥락에서만 완전히 설명될 수 있다.[3]공간적 대본체학 기법들은 세포의 성질을 이런 식으로 해명하려고 했다.아래에서는 유전자 발현을 세포의 공간적 조직과 연결하는 방법을 살펴본다.[3]

그림 1. 공간전사체학 방법의 개요.1, 마이크로분해법. 2. 상황혼합법. 3. 상황순서법. 4. 상황포착법. 5. 실리코법.[4]

미세분해

레이저 캡쳐 마이크로분해

레이저 캡쳐 마이크로분리는 형태변형을 일으키지 않고 단일 세포를 캡처할 수 있다.[5][6]역사학 부분에 부착된 투명한 에틸렌 비닐 아세테이트 필름과 저전력 적외선 레이저 빔을 활용한다.[5]일단 그러한 빔이 관심 세포들을 향하게 되면, 목표 영역 바로 위의 필름은 일시적으로 녹아서 그것의 긴 사슬의 폴리머가 세포를 덮고 단단히 포획한다.[5]그런 다음 섹션이 제거되고 관심 세포가 필름에 그대로 박혀 있다.[5]이 방법은 추가로 RNA 대본 프로파일링과 회수된 세포의 cDNA 라이브러리 생성을 가능하게 한다.

개별 극저온의 RNA 시퀀싱

개별 극저온 검사에서 선택된 부위의 RNA 염기서열은 위치 기반 게놈 전체 표현 데이터를 생성할 수 있는 또 다른 방법이다.[7]이 방법은 레이저 캡쳐 미세분해 없이 진행된다.그것은 처음에 극저온 상태의 드로소필라 배아에서 유전자 발현의 게놈 폭의 공간 패턴을 알아내기 위해 사용되었다.[7]본질적으로, 그것은 샘플의 선택된 지역에서 도서관을 간단하게 준비하는 것을 의미한다.이 방법은 각 슬라이스의 총 RNA 양이 적기 때문에 재료 손실이 발생하여 각 섹션에서 고품질 RNA-seq 라이브러리를 획득하는 데 어려움이 있었다.[3][7]이 문제는 초기 RNA 추출 후 각 관에 먼 관계가 있는 드로소필라 종의 RNA를 추가함으로써 해결되었다.[7]

티바

TIVA(Transcriptome invivo Analysis, TIVA)는 온전한 생조직 부분의 살아있는 단일 세포에서 mRNA를 캡처할 수 있는 기법이다.[8]그것은 사진 활성화 가능한 태그를 사용한다.[3][8]TIVA 태그에는 여러 기능 그룹이 있으며, 바이오틴에 결합된 덫에 걸린 폴리(U) 올리고뉴클레오티드가 있다.[8]태그에 인접한 이황화연계펩타이드로 세포막을 관통할 수 있다.[8]일단 안으로 들어가면 관심 세포의 폴리(U) 올리고뉴클레오티드를 차단하기 위해 레이저 광활성화를 이용, TIVA 태그가 세포 내의 mRNA에 혼합되도록 한다.[8]그런 다음, 바이오틴 그룹의 스트렙타비딘 캡처를 사용하여 차단되지 않은 태그에 묶인 폴리(A)꼬리 mRNA 분자를 추출하고, 그 후에는 이러한 mRNA를 RNA 염기서열에 의해 분석한다.[8]이 방법은 한 번에 몇 개의 셀만 처리할 수 있기 때문에 낮은 처리량에 의해 제한된다.[3]

토모섹

위에서 설명한 개별 극저온의 RNA 시퀀싱에 대한 고급 대안인 RNA 단층촬영(tomo-seq)은 RNA 정량화와 공간 분해능이 더 뛰어난 것이 특징이다.[9]또한 개별 섹션의 추가 RNA 염기서열 분석을 통한 조직 극저온 절제술, 게놈 폭의 표현 데이터 산출 및 공간 정보 보존에 기초하고 있다.[9]본 프로토콜에서는, 개별의 히스토리학 부분에서의 cDNA의 선형 증폭으로 인하여 반송파 RNA의 이용이 생략된다.[9]동일한 표본을 다른 방향으로 분할한 후 중복 데이터를 이용한 3D 전사 시공.[9]전체적으로 이 방법은 각 섹션에 동일한 샘플을 사용하는 것을 의미하므로 임상 물질 처리에 적용할 수 없다.[3]

LCM-seq

LCM-seq는 Smart-Seq2 RNA 염기서열과 결합된 레이저 캡처 마이크로디섹션(LCM)을 활용하며 단일 셀 레벨까지 적용 가능하며 부분적으로 분해된 조직에까지 사용할 수 있다.이 작업흐름에는 조직의 극저온방출에 이어 레이저 캡쳐 미세분해술에 따른 세포가 용해 완충액으로 직접 수집되고, RNA 격리가 필요 없이 cDNA가 생성되어 둘 다 실험 절차를 간소화하고 기술적 노이즈를 낮춘다.[10][11]LCM 절차 중 각 셀의 위치정체성을 기록하므로 해당 cDNA 라이브러리의 RNA 염기서열화 후 각 셀의 성적서(transcriptom)를 격리된 위치로 유추할 수 있다.[10]LCM-seq는 오쿨로모터 뉴런, 안면모터 뉴런, 저손실모터 뉴런, 척수모터 뉴런, 적핵 뉴런,[12][13] 내부유전자,[14] 도파민 뉴런, 연골세포 등 여러 세포 유형에 적용돼 그 본질적 성질을 파악했다.[15]

지오젝

지오섹은 레이저 캡쳐 미세분해술과 단세포 RNA 염기서열 분석 절차를 모두 활용해 약 10개 세포 크기의 조직 영역에 있는 텔레스콤의 공간 분포를 결정하는 방식이다.[16]그 작업 흐름은 레이저 캡쳐 미세분해에 따른 조직의 제거와 극저온 절제를 포함한다.[16][17]추출된 조직은 리스로 처리되고, RNA는 정제되어 역 필사되어 cDNA 라이브러리에 저장된다.[16][17]라이브러리의 순서를 정하고, 대본 프로파일을 추출된 조직의 원래 위치에 매핑할 수 있다.[16][17]이 기법은 사용자가 조직에서 관심 영역을 정의하고, 해당 조직을 추출하고, 표적 접근 방식으로 transcriptome을 매핑할 수 있도록 한다.

NIECH-seq

NIECH-seq 방법은 광활성화가 가능한 형광 마커와 투포톤 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 생성된 대본에 공간 데이터를 제공한다.[18]형광 표시기로 묶인 셀은 형광 활성 셀 정렬을 통해 광활성화, 분리 및 정렬된다.[18]이것은 라벨이 부착된 광활성 셀에만 정렬 특수성을 제공한다.[18]정렬 후, 단세포 RNA 염기서열은 시각화된 세포의 성적 증명서를 생성한다.[18]이 방법은 틈새에서 셀 사이의 공간 데이터를 손실하는 비용으로 정의된 틈새 내에서 수천 개의 셀을 처리할 수 있다.[18]

프록시ID

ProximID는 추출된 조직을 단일 세포로 반복적으로 소화하는 방법을 말한다.[19]초기 순한 소화 단계는 소화가 계속되기 전에 기록된 작은 상호작용 구조를 보존한다.[19]그런 다음 단일 셀은 각 구조에서 분리되어 sc-RNAseq를 거치고 t-분산 확률적 이웃 임베딩을 사용하여 군집화한다.[19][20]군집화된 셀은 마이크로 소화가 진행되기 전에 상호 작용하는 구조에 기초하여 물리적 상호작용에 매핑될 수 있다.[19]이 기법의 처리량은 상대적으로 낮지만 데이터 집합에 대한 셀 사이의 물리적 상호작용에 대한 정보를 제공한다.[3]

상황혼합형에서의 형광등

스마피시

개별 세포의 RNA 프로파일링을 공간적으로 해결할 수 있는 첫 번째 기법 중 하나는 smFish(simeth 하이브리드화)에서 단일 분자 형광이었다.[21]그것은 5개의 플루오포레와 결합된 짧은 (50개의 기본 쌍) 올리고뉴클레오티드 탐침을 구현했는데, 이것은 표본에서 밝은 점을 내는 특정 대본에 결합될 수 있다.[21]이러한 점의 검출은 세포 내 특정 유전자의 발현에 대한 정량적 정보를 제공한다.[21]그러나 여러 개의 불소 형상이 표시된 탐침의 사용은 자가 취합, 변형된 잡종 특성, 합성 및 정화에 의해 어려움을 겪었다.[3]

나중에, 이 방법은 위에서 설명한 프로브를 20bp 길이의 프로브로 대체하고, 하나의 플루오포레에 결합하고, mRNA 순서에 보완함으로써 변경되었는데[22], 이는 대상 mRNA에 집합적으로 결합됨을 의미한다.그러한 탐침 그 자체는 강한 신호를 생성하지는 못하겠지만, 집적 탐침의 누적 형광은 밝은 점을 보여줄 것이다.단일 오바인 프로브는 공동 국부화 가능성이 낮기 때문에 이 방법의 거짓 양성 신호는 제한적이다.[3]

그러므로 이것은 상황혼합(ISH) 기법에서 단일 세포에서 개별 RNA 분자의 직접 영상을 통해 RNA 발현의 공간적 국소화를 포착한다.

RNA스코프

RNAscope라고 불리는 또 다른 상황혼합화 기술은 특정 Z자형 디자인의 프로브를 사용하여 혼합 신호를 증폭시키고 배경 노이즈를 억제한다.[23]RNAScope의 대부분의 단계는 고전적인 ISH 프로토콜과 유사하다.[23]조직 샘플은 슬라이드에 고정된 후 세포에 스며드는 RNAscope 시약으로 처리된다.Z-프로브는 목표 순서에 따라 쌍으로 묶었을 때만 유효하도록 설계된다.[23]이를 통해 이 방법의 다른 요소(프리앰프)가 Z-프로브의 상단 꼬리에 연결할 수 있다.[23]프리앰프가 부착되면 프리앰프는 다른 요소, 즉 다른 유형의 프로브에 바인딩되는 앰프: 라벨 프로브에 대한 바인딩 사이트 역할을 한다.[23]그 결과 목표 순서에 부피가 큰 구조물이 형성된다.가장 중요한 것은 프리앰프가 단일한 Z 프로브에 결합하지 못하기 때문에 비특정 결합은 신호 방출을 수반하지 않기 때문에 초기에 언급된 배경 노이즈를 제거한다.[3][23]

젝피시

상황혼합에서의 순차 형광법(seqFICH)은 mRNA의 공간적 맥락을 보존하고 단일 세포에서 직접 mRNA를 식별하는 또 다른 방법이다.[24][25]이 방법은 여러 라운드로 수행되며, 각각 형광 프로브 혼합, 이미징 및 연속 프로브 박리가 포함된다.[24]다양한 유전자가 각 라운드마다 다른 색상을 할당받아 독특한 시간 바코드를 생성한다.[24]따라서 seqFICH는 적색-녹색 등 순차적 색상 코드로 mRNA를 구분한다.그럼에도 불구하고, 이 기술은 자동 형광 배경과 각 라운드에서 사용되는 프로브의 수로 인해 높은 비용이 특징인 결함을 가지고 있다.[3]

머피시

그림 2. MERFICH 원칙의 도식적 표현.a, mRNA 관심 종에 할당된 이진 코드, 여기서 "1"은 짧은 형광 DNA 탐침을 나타낸다.b, 연속 잡종 회진, 그 사이에 표백은 함축되어 있지만 명확성을 위해 표시되지는 않는다.6회말에는 "1"과 "0"[4]의 디코딩된 조합으로 인해 다른 mRNA를 구분할 수 있다.

기존 FICH 방식은 뚜렷한 컬러 채널이 적어 동시에 분석할 수 있는 유전자가 적어 한계가 있어 멀티플렉스 오류로버스트 FICH가 이를 극복하도록 설계됐다.[26]멀티플렉스 오류-로보스트 피쉬(MERFICH)는 여러 차례의 잡화에서 바이너리 코드 유전자 라벨링을 채택한 단일 세포에서 동시에 영상화할 수 있는 RNA 종의 수를 크게 증가시킨다.[27]이 접근방식은 오류를 검출하고 수정하는 인코딩 방식을 사용하여 한 번에 140개의 RNA 종을 측정할 수 있다.[27]핵심 원리는 여러 차례 연속된 잡종화 라운드에서 나오는 신호를 결합하고 관심 유전자에 N비트 바이너리 바코드를 할당해 유전자를 식별하는 데 있다.[27]이 강령은 특정 탐침에 따라 달라지며 "1" 또는 "0" 값으로 구성되며 각각의 유전자 조합은 다르게 설정된다.[27]오류는 최소 3비트가 다른 2개의 코드와 함께 6비트 이상 코드를 사용하여 방지한다.[27]각각의 RNA 종에 대해 특정한 탐침이 만들어진다.[27]각 탐침은 20-30개의 염기쌍으로 구성되며 세포에 침투한 후 mRNA 시퀀스에 보완적으로 결합하는 표적 특이 올리고뉴클레오티드다.[27]그 다음, 다음과 같이 여러 번의 하이브리드화를 실시한다. 각 라운드에 대해 해당 바이너리 코드 위치에 "1"을 포함하는 프로브만 추가된다.[27]각 라운드의 끝에는 형광 현미경 검사를 사용하여 각 프로브를 찾는다.[27]예상대로, 할당된 위치에 "1"이 있는 mRNA만 캡처될 것이다.[27]그런 다음 사진이 포토블레이싱되고 새로운 하위 집합이 추가된다.[27]따라서, 우리는 수많은 RNA 종을 구별할 수 있게 하는 이진수 값의 조합을 찾아낸다.

smHCR

혼합 체인 반응(smHCR)에 의한 심층 단분자 RNA 검출은 진보된 seq이다.두꺼운 조직 샘플과 불투명한 조직 샘플에서 전형적인 자동 형광 배경의 복잡성을 극복할 수 있는 Fish 기법.[28]이 방법에서 다중 판독 프로브는 mRNA의 목표 영역과 결합된다.[28]표적은 정의된 하위절차에 부착된 일련의 짧은 DNA 탐사에 의해 검출된다.[28]각 DNA 탐침은 동일한 HCR 앰프를 위한 이니시에이터를 운반한다.[28]그런 다음, 불소 라벨이 부착된 DNA HCR 헤어핀이 샘플을 관통하여 시작 프로브에 부착되는 형광 증폭 폴리머로 조립한다.[28]멀티플렉스 연구에서는 위에서 설명한 것과 동일한 2단계 프로토콜을 사용한다. 즉, 모든 HCR 증폭기와 마찬가지로 모든 프로브 세트가 동시에 도입된다. 또한 추가 영상촬영에는 시각적으로 구별되는 플루오포어를 사용한다.[28]

osmFICE

cyclick-uroboros smFish(osmFICH)는 광학 혼잡의 도전을 극복하기 위한 smFish를 각색한 것이다.[29]osmFish에서는 대본을 시각화하고, 프로브가 벗겨지기 전에 이미지를 획득하고 새로운 대본을 다른 형광 탐침으로 시각화한다.[29]연속 회진 후 RNA의 공간 분포를 보기 위해 영상을 컴파일한다.[29]스크립트가 순차적으로 시각화되기 때문에 신호가 서로 간섭하는 문제를 제거한다.[3][29]이 방법을 사용하면 다른 관련 기술보다 큰 조직 단면의 고해상도 영상을 생성할 수 있다.[3]

젝피쉬+

SeqFICH+는 이후 형광 투과로 공간적 혼잡과 관련된 광학적 문제를 해결했다.[30]먼저 1차 프로브는 대상 mRNA에 도달한 다음 후속 프로브가 1차 프로브의 측면 영역에 바인딩되어 고유한 바코드가 발생한다.[30]각 판독 프로브는 이미지로 캡처되어 초확산 이미지로 축소된다.[30]이 방법을 사용하면 한 번에 최대 1만 개의 유전자를 대상으로 할 수 있다.[3]

디엔에이 현미경

DNA 현미경 검사는 상황 반응에서 여러 차례 연속적으로 수행되는 시퀀싱 데이터의 동시 보존과 함께 분자의 위치를 광학 없이 매핑하기 위한 독특한 영상법이다.[31]첫째, 세포가 고정되고 cDNA가 합성된다.[31]그런 다음 무작위화된 뉴클레오티드는 각 분자에 대해 고유한 라벨을 제공하면서 현장에서 cDNA를 대상으로 태그를 지정한다.[31]태깅된 대본은 상황 반응에서 두 번째에 증폭되고, 검색된 복사본은 결합되며, 새로운 무작위화된 뉴클레오티드가 추가된다.[31]각 연속 연결 이벤트는 고유한 이벤트 식별자를 제공하는 라벨로 표시된다.[31]그런 다음 알고리즘은 획득한 결합 시퀀스에서 디코딩된 분자 근접도를 기반으로 원본 대본의 영상을 생성하는 한편, 대상의 단일 뉴클레오티드 정보도 기록되고 있다.[31]

상황순으로 배열하여

자물쇠 프로브를 사용하는 ISS

ISS 자물쇠 방법은[32] 자물쇠 프로빙,[33] 롤링-순환 증폭(RCA),[34] 레그 케미컬에 의한 시퀀싱에 기초한다.[35]손상되지 않은 조직 부분 내에서 mRNA는 cDNA로 역번역되며, 이후 RNase H에 의한 mRNA 분해에 따른다.[3]그렇다면 이 방법을 어떻게 실행할 수 있을 것인가 하는 두 가지 방법이 있다.첫 번째 방법인 갭 타겟 시퀀싱은 레깅에 의해 시퀀싱 대상이 되는 프로브 끝단 사이의 간극으로 cDNA에 자물쇠 프로브를 바인딩하는 것을 포함한다.[3]그러면 DNA 중합이 이 틈을 메우고 DNA 동그라미가 DNA 감사에 의해 생성된다.[3]또 다른 방법, 바코드 대상 시퀀싱, 바코드 시퀀스를 가진 자물쇠 프로브의 DNA 원형화는 오직 레깅에 의해서만 수행된다.[3]이 방법의 두 버전에서, 끝은 묶여서 DNA의 원을 형성한다.[3]대상 증폭은 마이크로미터 크기의 RCA 제품(RCP)을 생성하는 RCA에 의해 수행된다.[3]RCA는 자물쇠 프로브 시퀀스의 반복으로 구성된다.[3]그런 다음 이러한 DNA 분자는 레깅에 의해 염기서열 분석을 받게 되며, 버전에 따라 탐침 내에서 갭이 채워진 시퀀스 또는 최대 4베이스 길이의 바코드를 인접한 끝단과 함께 디코딩한다.[3]no-갭 변형은 더 높은 민감도를 주장하는 반면, 갭이 채워진 것은 대본의 실제 RNA 시퀀스를 읽는 것을 의미한다.[3]이후 마이크로유체 플랫폼에서 자동화하고 하이브리드 기술에 의한 시퀀싱으로 시퀀싱을 대체하여 이 방법을 개선하였다.[3]

FISEQ

ISS 자물쇠처럼 [36]상황순서(FISSEQ)에서 형광은 역전사, 롤링-순환 증폭, 레깅 기법에 의한 시퀀싱 등을 사용하는 방식이다.[3]고정된 세포에서 공간적 대본 분석을 가능하게 한다.[3]RNA는 우선 정규 및 수정된 아민-바즈와 태그가 지정된 무작위 헥사머 RT 프라이머로 cDNA로 역 필사된다.[3]아민-바즈는 cDNA와 세포주변의 교차연결을 중재한다.[3]그리고 나서 cDNA는 레깅에 의해 순환되고 RCA에 의해 증폭된다.[3]그 결과 지름 200~400nm의 단일 가닥 DNA 나노볼이 얻어진다.[3]따라서 이러한 나노볼은 cDNA 시퀀스의 수많은 탠덤 반복으로 구성된다.그런 다음 레깅에 의해 SOLiD 시퀀싱을 통해 시퀀싱이 수행된다.[3]역전사 및 클론 증폭 RCP 두 제품의 위치는 앞서 언급한 세포 매트릭스 구성요소와 교차 연동을 통해 유지되며, 셀 내 상황 RNA-seq 라이브러리에 3D가 생성된다.[3]일단 다른 색상의 형광 탐침으로 묶이면 앰플은 신호를 시각적으로 감지할 수 있는 형광성이 되지만, 영상 처리 알고리즘은 신호 강도보다는 읽기 정렬에 의존한다.[3]

바리스타섹

현장 바코드 표적 시퀀싱(Barista-seq)은 효율이 5배 향상되고 판독 길이가 15 베이스를 증가시키며 일루미나 시퀀싱 플랫폼과 호환되는 갭 자물쇠 프로브 방법론을 개선한 것이다.[3][20]이 방법은 자물쇠 프로브와 롤링 서클 증폭도 사용하지만, 이 방법은 갭 자물쇠 방식과는 달리 합성별 시퀀싱과 크로스링크를 사용한다.[20]동일한 절차에서 셀룰러 매트릭스에 대한 교차 링크는 FISSEQ와 동일하다.[3][20]

스타맵

공간적으로 분해된 엠프리콘 판독 맵핑(STARMAP)은 자물쇠 프로브를 mRNA를 직접 증폭할 수 있는 프라이머와 함께 활용, 역전사 필요성을 배제한다.[3][37]다른 자물쇠 프로브 기반 방식과 유사하게 롤링 서클 증폭을 통해 증폭된다.[37]DNA 증폭기는 화학적으로 변형되어 세포 내의 중합 하이드로겔에 내장된다.[37]캡처된 RNA는 각 셀 내에서 mRNA의 3차원 위치를 제공하는 상황에서 시퀀싱될 수 있다.[37]

현장에서 붙잡혀.

공간대역학

조직 극저온절제가 공간적 대사로믹 슬라이드에 부착되면 바코드를 입힌 프라이머가 조직에서 인접한 mRNA를 바인딩하여 포획한다.조직 부분이 슬라이드에 부착되는 동안 캡처된 mRNA의 역전이 시작되고 그 결과 cDNA는 프라이머의 공간 바코드를 통합한다.mRNA 캡처 및 역전사에 이어 Illumina 염료 시퀀싱으로 시퀀싱 라이브러리를 준비하고 분석한다.생성된 각 시퀀스 내에 존재하는 공간 바코드를 통해 각 개별 mRNA 대본에 대한 데이터를 조직 섹션 내의 원래 지점으로 다시 매핑할 수 있다.

그림 3인지 공간역학 기법의 기초 메커니즘

GeoMx

NanoString의 DSP(GeoMx Digital Spatial Profiler)는 사용자가 현장 하이브리드화 프로브에 설계된 UV-광화성 바코드로 인해 FFPE나 냉동 조직 슬라이드에 미세한 관심 영역을 정의할 수 있다.[3][38]관심 영역은 특히 자외선에 노출되며 바코드는 분해되어 조직에 존재하는 RNA나 단백질을 식별하는 데 사용된다.[38]지정된 관심 영역은 10~600마이크로미터 사이에서 크기가 달라질 수 있으며, 역사학적 샘플의 다양한 구조와 셀을 대상으로 한다.[3]

슬라이드 젝트

슬라이드 젝트는 고무 코팅 유리 커버립에 RNA 결합, DNA 바코드 마이크로 비드의 부착에 의존한다.[3][39]마이크로 비드는 SOLiD 시퀀싱을 통해 공간 위치에 매핑된다.[39]조직 부분은 이 커버립으로 옮겨져 추출된 RNA를 포착하고 캡쳐된 RNA는 증폭되고 시퀀싱된다.[39]대본 로컬리제이션은 그것을 캡처한 비드에서 나온 바코드 올리고뉴클레오티드 순서에 의해 결정된다.[39]

에이펙스-섹

APEX-seq는 셀의 서로 다른 영역에서 공간적 대소문자를 평가할 수 있도록 허용한다.[3][40]이 방법은 바이오틴페놀과 과산화수소를 배양한 살아있는 세포에서 발현되는 APEX2 유전자를 활용한다.[40]이러한 조건에서 APEX2 효소는 RNA 분자에 대한 바이오틴 그룹의 전달을 촉진하며, 이러한 효소는 스트렙타비딘 비드 정화를 통해 정제될 수 있다.[40]그런 다음 정제된 성적 증명서를 배열하여 어떤 분자가 바이오틴 태깅 효소에 근접했는지를 결정한다.[40]

HDST

HDST(High-Definition Spatial Transcriptomics)는 유리 슬라이드의 우물에서 mRNA 캡처 비드의 위치를 해독하는 것으로 시작한다.[41]이것은 각 비드의 바코드 올리고뉴클레오티드 순서에 대한 순차적 혼합에 의해 달성된다.[41]각 비드의 위치가 디코딩되면, 조직 샘플을 슬라이드에 놓고 침투시킬 수 있다.[41]그런 다음 캡처된 녹취록의 순서를 정한다.[41]HDST는 슬라이드 젝트보다 작은 비드를 사용하므로 슬라이드 젝트의 10마이크로미터에 비해 2마이크로미터의 공간 분해능으로 해결할 수 있다.[3]

비슘 10배

10X Visium assay는 Spatial Transcriptomics assay의 새롭고 개선된 버전이다.또한 유리 슬라이드 표면에 있는 mRNA 캡처 프로브의 스폿 어레이를 활용하지만 스폿 번호가 증가하고 스폿 크기가 최소화되며 스폿당 캡처 프로브의 양이 증가하였다.Visium Spatial Gene Expression 슬라이드의 각 캡처 영역에는 약 5000개의 바코드된 지점이 있으며, 이 지점에는 공간적으로 바코드된 캡처 올리고뉴클레오티드가 수백만 개 들어 있다.조직 mRNA는 투과성화 시 방출되며 바코드화된 올리고에 결합되어 유전자 발현 정보의 캡처가 가능하다.바코드된 각 스폿은 직경이 55µm이며, 한 스팟의 중심에서 다른 스팟의 중심까지의 거리는 약 100µm이다.그 점들은 그들 사이의 거리를 최소화하기 위해 엇갈려 있다.평균적으로 1개에서 10개 사이의 셀 사이의 mRNA는 한 지점 당 캡처되어 거의 단일 셀 분해능을 제공한다.[42]

사일로 공사하여

ISH를 이용한 재구성

ISH를 이용한 실리코 공간 재구성은 세포의 표현 프로파일에 따른 위치의 계산적 공간 재구성을 의미한다.[3]이 원리의 몇 가지 유사한 방법이 존재한다.[43][44]그들은 동일한 세포 타입의 단일 세포 transcriptomics와 이용 가능한 ISH 기반 유전자 표현 아틀라스를 공동 분석한다.[3]이러한 데이터에 기초하여 세포는 조직에서 자신의 위치에 할당된다.분명히 이 방법은 ISH 참조의 가용성에 의해 제한된다.[3]게다가, 복잡한 조직에 세포를 배정할 때 더 복잡해진다.이 접근방식은 쌍체 참조가 없기 때문에 임상 샘플에는 적용되지 않는다.[3]보고된 뇌 조직 내 세포의 정확한 배분에 대한 성공률은 81%[43]이다.

디스트맵

디스트맵 알고리즘을 사용하여 transcriptome을 매핑하려면 높은 처리량의 단일 셀 시퀀싱과 관심 조직에 대한 상황 내 혼합화 지도책이 필요하다.[3][45]디스트맵 알고리즘은 시퀀싱된 셀과 해당 참조 아틀라스의 대본을 사용하여 관심 조직의 가상 3D 모델을 생성한다.[3][45]t-분산 확률적 이웃 임베딩을 사용하여 t-분산 확률적 이웃을 세포 유형으로 클러스터링할 수 있으며, 가상의 현장 혼합을 사용하여 3D 모델에 매핑할 수 있다.[45][46]본질적으로, 이 알고리즘은 분리된 조직의 단일 세포에서 생성된 데이터를 취하며, 개별 대본을 가상의 상황 혼합을 이용하여 세포 유형이 조직 내에 존재하는 곳에 매핑할 수 있다.

역사

현장 교배는 60년대 후반에 개발되었으며, 80년대(smFish), 10년대(RNAscope, seqFish, MERFish, osmFish)에서 주요 발전이 있었으며, 가장 최근에 추가된 것은 seqFish+와 DNA 현미경이다.[16]미세분해 기술은 90년대 후반(레이저 캡쳐 마이크로분해)에 처음 개발되었으며, 가장 최근의 추가는 프록심 개발로 2016년이다.한 기법으로 ID.[3]공간 genomics/transcriptomics과 2000년에 개발된 마이클 도일(Eolas의), 모리스 Pescitelli(시카고에 있는 일리노이 대학의), 베시 윌리엄스(하버드의)을 하고 있는 조지 마이클스가 대상물의 배아 프로젝트의 일환으로 추후에 2016년 늘렸다[49](조지 메이슨 대학교의)[1][47][48]발명되었다.조나스 Frisén에 의해,스웨덴 스톡홀름에 있는 요아킴 룬데베르크, 파트리크 스탈과 그들의 동료들.[2]2019년 브로드 연구소에서 페이 첸과 에반 마코스코의 연구소는 구슬에 바코드를 입힌 올리고를 사용한 슬라이드 젝트를 개발했다.[39]

참고 항목

단일 셀 시퀀싱

단세포역학

RNA-Seq

상황 잡종에서의 형광

참조

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