세포무단백질배열

Cell-free protein array

세포가 없는 단백질 배열 기술은 DNA 템플릿에서 대상 단백질의 체외 합성을 수행하여 단백질 미세선을 생성한다.단백질 미세선을 합성하는 이 방법은 단백질 배열 생산의[1] 전통적인 방법들이 직면하고 있는 많은 장애물과 도전들을 극복하여 단백질학에서 단백질 미세선의 광범위한 채택을 막았다.이 기술로 만들어진 단백질 배열은 단백질-단백질 상호작용과 DNA, 지질 등 다른 세포 분자와의 단백질 상호작용 테스트에 사용될 수 있다.효소 억제 측정과 항체 특이성 선별을 포함한 다른 응용 프로그램도 있다.

개요 / 배경

DNA 마이크로레이의 급격한 성공은 단백질 마이크로레이에 대한 많은 열정을 불러일으켰다.그러나 DNA 마이크로레이에서 필요한 도구와 노하우가 마련되어 적응할 준비가 되어 있음에도 불구하고 단백질 마이크로레이는 기대만큼 잘 벗겨지지 않았다.한 가지 주요한 이유는 단백질 미세조정이 DNA 미세조영보다 훨씬 더 힘들고 기술적으로 만들기 어렵기 때문이다.

전통적인 단백질 배열 생산 방법은 수백, 수천 개의 단백질의 체내 분리 발현을 필요로 하며, 이어서 단단한 표면에 있는 단백질의 분리 정화와 고정화가 필요하다.세포가 없는 단백질 배열 기술은 박테리아 세포의 단백질을 표현해야 할 필요성과 그에 따른 정화 필요성을 우회하여 단백질 미세배열 구조를 단순화하려고 시도한다.DNA 템플릿, 전사, 번역 원료 및 기계 등이 포함된 세포 추출물이 제공되면 온전한 세포 없이도 단백질 합성이 가능하다는 것을 입증한 세포 없는 단백질 합성 기술을 활용한다.[2]세포가 없는 단백질 배열 기술에 사용되는 세포 추출물의 공통 공급원은 밀 세균, 대장균, 토끼 망막세포 등이다.또한 고열성, 혼혈아, 제노푸스 난모세포, 곤충, 포유류, 인간 세포와 같은 다른 원천에서 추출한 세포도 사용되었다.[3]

대상 단백질은 DNA 템플릿에서 직접 단백질 마이크로어레이의 자리에서 합성되므로 기존의 단백질 마이크로어레이 생산의 많은 단계와 그에 수반되는 기술적 한계는 생략한다.더 중요한 것은 단백질의 발현이 병행될 수 있다는 것인데, 이는 모든 단백질이 하나의 반응으로 함께 발현될 수 있다는 것을 의미한다.이러한 단백질 발현능은 생산 과정에서 주요한 시간 절약이다.

합성 방법

상황별 방법

현장법에서는 단백질 포획 시약이나 항체로 미리 코팅한 단백질 배열 표면에서 단백질 합성을 실시한다.일단 새로 합성된 단백질이 리보솜에서 배출되면 각 초기 단백질의 N- 또는 C-terminus에서도 합성되는 태그 시퀀스는 포획 시약이나 항체에 의해 결합되어 단백질을 고정시켜 배열을 형성하게 된다.일반적으로 사용되는 태그에는 폴리히스타딘(His)6과 글루타티온느 s-transferase(GST)가 있다.

다양한 연구 그룹들이 각자 접근방식이 다른 나름대로의 방법을 개발했지만, 세 가지 주요 그룹으로 요약할 수 있다.

NAPPA의 도표

핵산 프로그램 가능 단백질 배열(NAPPA)

NAPPA는[4] 동일한 단백질 포획 표면에 이미 고정된 DNA 템플릿을 사용한다.DNA 템플릿은 비오티닐로 되어 있으며 단백질 포획 표면에 미리 코팅된 아비딘과 결합되어 있다.GST로 태그가 된 새로 합성된 단백질은 포획 표면에 사전 코팅된 인접한 폴리클론 항 GST 포획 항체에 결합하여 템플릿 DNA 옆에 고정된다.이 방법의 주요 단점은 프로세스 시작 시 추가적이고 지루한 준비 단계 (1) 표현 가능 벡터에서의 cDNA 복제, (2) 플라스미드 DNA를 생물비닐화하되 전사에는 간섭하지 않는 필요성이다.더욱이 그 결과 단백질 배열이 '순수'가 아닌 것은 단백질이 DNA 템플릿과 함께 국부화되어 항체를 포획하기 때문이다.[3]

PISA의 도표

PISA(Parth Array)

NAPPA와 달리, PISA는[5] DNA 템플릿이 반응 혼합물에서 자유 분자로 추가됨에 따라 DNA 고정화를 완전히 우회한다.2006년 또 다른 집단은 최대 1만3000개의 점점이 있는 고밀도 단백질 마이크로어레이에서 DNA 템플릿과 세포 없는 전사·번역 혼합물을 포착하는 다중 스폿팅 기법으로 이 방법을 정제·소형화했다.[6]이것은 작은 나노미터 이하의 방울에서 일어나는 전사/번역 반응에 대한 시약을 정확하고 순차적으로 공급하기 위해 사용되는 자동화된 시스템에 의해 가능해졌다.

현장 푸로마이신 캡쳐 다이어그램

현장에서 푸로마이신 캡쳐

이 방법은 mRNA 디스플레이 기술을 적용한 것이다.PCR DNA는 먼저 mRNA로 옮겨지고, 양쪽 끝의 바이오틴과 푸로마이신(Puromychin)으로 변형된 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드(DNA olgonucleotide)는 이후 mRNA의 3'끝까지 교배된다.그런 다음 mRNA는 슬라이드에 배열되고 슬라이드에 미리 코팅된 스트렙타비딘에 대한 바이오틴의 결합으로 고정된다.세포 추출물은 슬라이드 위에서 현장 번역이 이루어지도록 분배된다.리보솜이 잡종화된 올리고뉴클레오타이드에 도달하면 멈춤으로써 푸로마이신 분자를 초기의 폴리펩타이드 체인에 통합시켜, 새롭게 합성된 단백질을 DNA 올리고뉴클레오타이드(Olgonucleotide)를 통해 마이크로 어레이에 부착한다.[7]순수 단백질 배열은 mRNA를 RNase로 소화한 후에 얻는다.이 방법에 의해 생성되는 단백질 점들은 매우 날카롭게 정의되어 있고 높은 밀도에서 생성될 수 있다.

나노웰 배열 형식

그림 4: 나노웰 어레이 형식의 도식도

나노웰 배열 형식은 개별 단백질을 소량 반응 혈관이나 나노웰로[8][9] 표현하는데 사용된다(그림 4).이 형식은 때때로 단백질 활동의 잠재적 손실을 초래할 수 있는 표적 단백질을 고정시킬 필요가 없기 때문에 선호된다.어레이의 소형화는 또한 검사 검사에 사용될 수 있는 용액과 귀중한 화합물을 보존한다.또한 개별 유정의 구조적 특성은 챔버 간의 교차 오염을 방지하는 데 도움이 된다.2012년에 나노웰 배열을 사용하여 확산을 방지하는 개선된 NAPPA가 발표되었다.여기서 DNA는 항 GST 항체와 함께 우물에 고정되었다.그런 다음 세포가 없는 표현 혼합물을 첨가하고 우물은 뚜껑에 의해 닫혔다.GST-태그를 포함하는 초기 단백질은 웰 표면과 결합되어 높은 밀도와 거의 교차 결합이 없는 NAPPA 어레이를 가능하게 했다.[10]

DNA 배열과 단백질 배열 연결(DAPA)

그림 5: 방위사업청 계통도

DNA-단백질 배열(DNAAPA)은 단일 DNA 템플릿 배열에서 필요에 따라 '인쇄[11]'하여 단백질 배열을 반복적으로 생산하기 위해 2007년 개발한 방법이다(그림 5).그것은 유리 슬라이드에 있는 일련의 DNA 템플릿의 얼룩과 고정으로 시작한다.그런 다음 슬라이드를 단백질 캡처 시약으로 미리 코팅한 두 번째 슬라이드로 대면 조립하고, 두 슬라이드 사이에 셀 추출물로 적신 막을 배치해 전사 및 번역이 이뤄진다.새로 합성된 그의 태그 단백질은 슬라이드 위에 고정되어 배열을 형성한다.20개의 복제 중 18개의 출판물에서 단백질 마이크로 어레이 복사본이 생성될 수 있다.DNA가 DNA의 손상, 분해 또는 기계적 마멸에 의해 손상되지 않는 한, 잠재적으로 그 과정은 필요한 만큼 자주 반복될 수 있다.

이점

세포가 없는 단백질 배열 기술의 많은 장점들은 단백질 마이크로 배열 생산의 전통적인 방법에 사용되는 세포 기반 표현 시스템의 한계를 다룬다.

신속하고 비용 효율적인

이 방법은 DNA 복제를 피하고(NAPPA 제외) PCR DNA를 이용해 유전자 정보를 기능 단백질로 신속하게 변환할 수 있다.생산 단계 감소와 시스템 소형화 능력은 시약 소비를 줄이고 생산 비용을 절감한다.

단백질 가용성 향상

항체를 포함한 많은 단백질은 불임성, 이황화 결합 또는 숙주 세포 독성의 문제 때문에 숙주 세포에서 표현하기 어렵다.[1]세포가 없는 단백질 배열은 그러한 단백질의 많은 부분을 단백질 마이크로레이에 사용할 수 있게 한다.

장기 저장 가능

단백질은 안정성이 높은 분자인 DNA와 달리 안정성과 생리화학성이 다른 이질적인 분자종류다.단백질의 접힘과 기능을 장기간 보관하는 동안 고정된 상태로 유지하는 것은 단백질 마이크로레이의 주요 도전이다.세포가 없는 방법은 필요에 따라 단백질 미세선을 신속하게 얻을 수 있는 옵션을 제공하므로 장기 저장과 관련된 문제를 없앨 수 있다.

신축성

이 방법은 PCR 제품, 플라스미드 및 mRNA와 같은 다양한 템플릿에 적용할 수 있다.단백질 접힘, 이황화 결합 형성, 변형 또는 단백질 활동을 위한 환경을 조정하기 위해 합성 중에 추가 성분을 포함할 수 있다.[3]

한계

  • 세포가 없는 단백질 합성에 의해 생성되는 단백질 내 단백질의 변환 후 수정은 전통적인 방법에 비해 여전히 제한적이며,[13] 생물학적으로 그다지 관련이 없을 수도 있다.

적용들

단백질 상호작용:대사물, 지질, DNA 및 소분자와 같은 다른 분자와의 단백질-단백질 상호작용[4] 및 단백질 상호작용을 검사한다.;[14] 효소 억제 측정:[8] 높은 처리량의 약물 후보 선별 및 생명공학에 사용할 새로운 효소 발견; 항체 특이성 검사.[15]

참조

[16]

  1. ^ a b 스티븐스, R. C. (2000년)"구조적 생물학을 위한 단백질 생산의 고투과 방법의 설계"구조 8(9): R177-R185.
  2. ^ Katzen, F, G. Chang 등.(2005)."세포 없는 단백질 합성의 과거, 현재, 미래."트렌드 바이오테크놀 23(3): 150–6.
  3. ^ a b c 그, M, O. Stovesandt 등.(2008)."단백질 배열의 현장 합성"커러 오피니언 바이오테크놀 19(1): 4–9.
  4. ^ a b 라마찬드란, N, E. 하인스워스 외(2004)."자체조립 단백질 미세조립"과학 305(5680): 86-90.
  5. ^ 그, M., M. J. 타우식(2001)이다."세포를 사용하지 않는 표현과 상황 고정(PISA 방법)에 의해 DNA로부터 단백질 배열을 한 단계 생성"핵산 자원 29(15): E73-3.
  6. ^ Angenendt, P, J. Kreutzberger 등.(2006)."정화되지 않은 PCR 제품의 현장 표현에서 세포가 없는 고밀도 단백질 마이크로레이 생성"Mol Cell Proteomics 5(9): 1658–66.
  7. ^ Tao, S. C., H. Zhu(2006)."초기 폴리펩타이드 포획에 의한 단백질 칩 제작"NAT 바이오테크놀 24(10): 1253–4.
  8. ^ a b Angenendt, P, L. Nyarsik 등.(2004)."나노웰 칩 형식의 무세포 단백질 발현 및 기능분석"항문 화학 76(7): 1844–9.
  9. ^ 킨파라, T, R. 미즈노 외(2004)."세포 없는 단백질 합성을 위한 피콜레이터 챔버 배열." J 생화학 136(2): 149–54.
  10. ^ Takulapalli BR, Qiu J 외 (2012)"고밀도 확산 무 나노웰 어레이."J Proteome Res. 11(8):4382-91
  11. ^ 그, M, O. Stovesandt 등.(2008)."DNA 어레이에서 단백질 어레이를 인쇄하는 중."NAT 방법 5(2): 175–7.
  12. ^ 2007년 11월 7일 웨이백 머신에 보관된 Promega 체외 표현 가이드
  13. ^ Chatterjee, D.K., J. LaBaer(2006)."단백질 기술."커르 오피니언 바이오테크놀로지 17(4): 334–336.
  14. ^ 그, M., M. W. W. W. Wang(2007)이다."세포 없는 합성에 의해 단백질을 배양한다."바이오몰 Eng 24(4): 375–80.
  15. ^ 그는 M.와 M. J. 타우식(2003)이다."DissernArray 기술: PCR DNA로부터 단백질 배열을 생성하기 위한 세포 없는 방법." J Immunol Methods 274(1–2): 265–70.
  16. ^ [1].

외부 링크