표현 벡터

Expression vector
T7 프로모터의 녹색 형광 단백질을 표현하기 위한 박테리아 표현 벡터.

표현형 벡터는 표현형 구조로 알려져 있으며, 보통 세포 내 유전자 발현을 위해 고안된 플라스미드 또는 바이러스다. 벡터는 특정 유전자를 표적 세포에 도입하는 데 사용되며, 단백질 합성을 위한 세포의 메커니즘을 명령하여 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 표현 벡터는 단백질의 생산을 위한 생명공학의 기본 도구다.

벡터는 촉진제 및 촉진제 영역으로 작용하고 표현 벡터에 전달되는 유전자의 효율적인 전사로 이어지는 규제 시퀀스를 포함하도록 설계된다.[1] 잘 설계된 표현 벡터의 목표는 단백질의 효율적인 생산이며, 이것은 상당한 양의 안정적인 전달자 RNA의 생산에 의해 달성될 수 있으며, 이는 단백질로 변환될 수 있다. 단백질의 표현은 엄격히 통제될 수 있으며, 단백질은 인덕터의 사용을 통해 필요할 때만 상당한 양으로 생산되지만, 어떤 시스템에서는 단백질이 구성적으로 표현될 수 있다. 대장균은 일반적으로 단백질 생산의 숙주로 사용되지만, 다른 세포 유형도 사용될 수 있다. 표현 벡터를 사용하는 예로는 당뇨병을 치료하는 데 쓰이는 인슐린의 생산을 들 수 있다.

요소들

표현 벡터에는 복제의 기원, 선택 가능한 표식기, 다중 복제 사이트와 같은 유전자의 삽입에 적합한 사이트 등 어떤 벡터도 가질 수 있는 특징이 있다. 복제된 유전자는 표현 벡터로 직접 복제하는 것은 가능하지만, 특수한 복제 벡터에서 표현 벡터로 옮겨질 수도 있다. 복제 과정은 보통 대장균에서 이루어진다. E.coli 이외의 유기체에서 단백질 생성을 위해 사용되는 벡터는 대장균에서 번식을 위한 적절한 복제 원인에 더하여 다른 유기체에서 유지될 수 있도록 하는 원소를 가질 수 있으며, 이러한 벡터를 셔틀 벡터라고 한다.

표현 요소

추가 정보: 전사(유전자) 및 번역(생물학)

표현 벡터에는 유전자 발현에 필요한 요소가 있어야 한다. 여기에는 프로모터, 리보솜 결합 사이트 및 시작 코돈과 같은 올바른 번역 시작 순서, 종료 코돈 및 전사 종료 순서가 포함될 수 있다.[2] 원핵생물과 진핵생물의 단백질 합성을 위한 기계에는 차이가 있으므로, 표현 벡터는 선택된 숙주에 적합한 표현 요소를 가지고 있어야 한다. 예를 들어 원핵생물 표현 벡터는 리보솜 결합을 위한 번역 개시 사이트에서 샤인 달가노 시퀀스를 갖는 반면, eukaryotes 표현 벡터는 코작 일치 시퀀스를 포함할 것이다.

발기인은 전사를 시작하며 따라서 복제 유전자의 발현을 통제하는 지점이다. 표현 벡터에 사용되는 촉진자는 일반적으로 유도성이 있는데, 이는 단백질 합성이 IPTG와 같은 유도체의 도입에 의해 필요할 때만 시작된다는 것을 의미한다. 그러나 유전자 표현은 어떤 표현 벡터에서도 구성적일 수 있다(즉, 단백질이 지속적으로 표현된다). 구성 단백질 합성의 낮은 수준은 엄격하게 통제된 발기인과의 표현 벡터에서도 발생할 수 있다.

단백질 태그

주요기사 : 단백질 태그

유전자 생산물의 발현 후, 표현된 단백질을 정화하는 것이 필요할 수 있지만, 숙주 세포의 대부분의 단백질에서 관심의 단백질을 분리하는 것은 장기적인 과정이 될 수 있다. 이 정화 과정을 더 쉽게 하기 위해, 복제 유전자에 정화 태그를 추가할 수도 있다. 이 태그는 히스티딘(His) 태그, 기타 마커 펩타이드 또는 글루타티온 S-전달효소 또는 말토오스 결합 단백질과 같은 퓨전 파트너일 수 있다.[3] 이러한 핵융합 파트너들 중 일부는 표현된 단백질의 용해도를 증가시키는데 도움을 줄 수도 있다. 녹색 형광 단백질과 같은 다른 핵융합 단백질은 성공적인 복제 유전자의 식별을 위한 리포터 유전자의 역할을 할 수도 있고, 세포 이미지에서 단백질 발현을 연구하는 데 사용될 수도 있다.[4][5]

기타 요소

표현 벡터는 단백질 합성을 위해 숙주세포로 변형되거나 전염된다. 일부 표현 벡터에는 변환을 위한 요소나 DNA를 호스트 염색체에 삽입하는 요소, 예를 들어 식물 변환을 위한 처녀 유전자와 염색체 통합을 위한 통합 현장이 있을 수 있다.

일부 벡터는 박테리아의 경련 공간과 같은 특정 위치로 표현된 단백질을 표적으로 삼을 수 있는 표적 시퀀스를 포함할 수 있다.

표현/생산 시스템

유전자의 표적 단백질을 표현하기 위해 다른 유기체가 사용될 수 있으며, 따라서 사용되는 표현 벡터는 특정한 유기체에서 사용하기 위해 특정한 원소를 가질 것이다. 단백질 생산에 가장 많이 사용되는 유기체는 대장균 박테리아다. 그러나 모든 단백질이 대장균에서 성공적으로 발현되거나 글리코실레이션과 같은 변환 후 수정체의 정확한 형태로 발현될 수 있는 것은 아니며, 따라서 다른 시스템을 사용할 수도 있다.

세균

박테리아 표현 벡터의 예로는 pGEX-3x 플라스미드가 있다.

많은 단백질의 발현을 위한 표현 숙주는 대장균이다. 대장균에서 이질성 단백질의 생성이 비교적 간단하고 편리할 뿐만 아니라 빠르고 저렴하기 때문이다. 대장균 발현 플라스미드도 다양하게 이용할 수 있다. 단백질 생산에 사용되는 다른 박테리아로는 바실러스 미분비가 있다.

대부분의 이질성 단백질은 대장균의 세포질에서 발현된다. 그러나 형성된 모든 단백질이 세포질 내에 용해되는 것은 아닐 수 있으며, 세포질 속에 형성된 잘못 접힌 단백질은 포화체라는 불용성 골재를 형성할 수 있다. 그러한 불용성 단백질은 리폴딩이 필요할 것이며, 이것은 관련된 과정이 될 수 있고 반드시 높은 수율을 생산하지 않을 수도 있다.[6] 이울피드 결합을 가진 단백질은 그러한 결합 형성을 방해하는 세포질 내 환경이 축소되어 제대로 접히지 못하는 경우가 많으며, 가능한 해결책은 N단자 신호 시퀀스를 이용하여 단백질을 근막 공간까지 표적으로 하는 것이다. 또 다른 가능성은 세포질의 리독스 환경을 조작하는 것이다.[7] 다른 더 정교한 시스템들도 개발되고 있다; 그러한 시스템들은 글리코실레이트 단백질과 같이 이전에 대장균에서 불가능하다고 생각되었던 단백질의 발현을 허락할 수도 있다.[8][9][10]

이러한 벡터에 사용되는 프로모터는 대개 라크 피연산자의 프로모터나 T7 프로모터를 기반으로 하며,[11] 일반적으로 라크 오퍼레이터에 의해 규제된다. 예를 들어,[12] Tac-Promoter는 trp와 lac 프로모터의 혼합체일 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 lac 또는 lac-derated 프로모터는 catabolite 억제에 무감각한 lacUV5 돌연변이를 기반으로 한다는 점에 유의하십시오. 이 돌연변이는 와일드 타입의 라크 프로모터를 사용하면 포도당이 유전자 발현을 억제하기 때문에 성장 매체에 포도당이 포함되어 있을 때 라크 프로모터의 통제 하에 단백질의 발현을 허용한다.[13] 그럼에도 불구하고 포도당의 존재는 일부 시스템에서 잔류 억제를 통해 배경 표현을 줄이는 데 여전히 사용될 수 있다.[14]

대장균 발현 벡터의 예로는 글루타티온 S-전달효소가 핵융합 파트너로 사용되고 유전자 발현이 TAC 추진자의 지배하에 있는 pGEX 벡터 시리즈와 [15][16][17]T7 발현자를 사용하는 pET 벡터 시리즈가 있다.[18]

다른 플라스미드를 사용하여 대장균에서 둘 이상의 다른 단백질을 동시에 표현할 수 있다. 그러나, 2개 이상의 플라스미드를 사용할 때, 각 플라스미드는 다른 항생제 선택뿐만 아니라 다른 복제 기원을 사용할 필요가 있으며, 그렇지 않으면 하나의 플라스미드가 안정적으로 유지되지 않을 수 있다. 일반적으로 사용되는 많은 플라스미드는 ColE1 환지체에 기초하므로 서로 호환되지 않는다. 따라서 콜E1 기반 플라스미드가 동일한 셀에서 다른 것과 공존하기 위해서는 다른 환지(예: p15A 환지 기반 플라스미드 시리즈와 같은 p15A 환지 기반 플라스미드)가 있어야 한다.[19] 또 다른 접근방식은 단일 2-시스트론 벡터를 사용하거나 바이-시스트론 또는 폴리-시스트론 구조로 나란히 코딩 시퀀스를 설계하는 것이다.[20][21]

효모

단백질 생산에 흔히 쓰이는 효모는 피치아목사이다.[22] 피치아에서 효모 발현 벡터의 예로는 벡터의 pPIC 시리즈가 있으며, 이들 벡터는 메탄올으로 유도할 수 있는 AOX1 프로모터를 사용한다.[23] 플라스미드는 효모 게놈에 외래 DNA를 삽입하기 위한 원소와 표현된 단백질의 분비를 위한 신호 시퀀스를 포함할 수 있다. 이설화 결합과 글리코실화를 가진 단백질은 효모에서 효율적으로 생산될 수 있다. 단백질 생산에 사용되는 또 다른 효모는 Kluyveromyces latis이며 유전자는 강한 락타아제 LAC4 프로모터의 변종에 의해 발현된다.[24]

사카로마이오스 세레비시아는 단백질-단백질 상호작용 연구를 위한 효모 2-하이브리드 시스템 등 효모의 유전자 발현 연구에 특히 널리 사용된다.[25] 효모 2-하이브리드 시스템에 사용되는 벡터에는 복제 유전자에서 발현된 두 단백질 사이에 상호작용이 있을 때 리포터 유전자를 전사시킬 수 있는 두 개의 복제 유전자에 대한 융합 파트너가 들어 있다.

바쿨로바이러스

곤충 세포를 감염시키는 막대 모양의 바이러스인 바쿨로바이러스는 이 시스템에서 표현 벡터로 사용된다.[26] 스포도프테라 과실기페르다 등 레피도프테란스(못과 나비)에서 유래한 곤충 세포선이 숙주로 사용된다. 양배추 루퍼에서 파생된 세포 라인은 세포 성장을 촉진하는 데 일반적으로 필요한 값비싼 혈청 없이 빠르게 성장하도록 개발되었기 때문에 특히 관심을 끈다.[27][28] 셔틀 벡터는 bacmid라고 불리며, 유전자 표현은 강력한 프로모터 pPolh의 지배하에 있다.[29] 바쿨로바이러스는 또한 바크맘 시스템에서 포유류 세포 라인과 함께 사용되어 왔다.[30]

바쿨로바이러스는 보통 당단백질의 생산에 사용되지만, 당단백질은 척추동물에서 발견되는 것과 다를 수 있다. 일반적으로 포유류 바이러스보다 안전한데, 숙주범위가 한정돼 있고 수정 없이 척추동물을 감염시키지 않기 때문이다.

식물

많은 식물 표현 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스의 Ti 플라스미드를 기반으로 한다.[31] 이러한 표현 벡터에서, 식물에 삽입될 DNA는 T-DNA에 복제되며, 양쪽 끝에서 25-bp의 직접 반복 순서에 의해 옆으로 늘어선 DNA로, 식물 게놈에 통합될 수 있다. T-DNA에는 선택 가능한 마커도 포함되어 있다. 아그로박테리움은 식물 게놈으로의 변환과 통합을 위한 메커니즘을 제공하며, 그것의 처녀 유전자에 대한 촉진제 또한 복제 유전자에 사용될 수 있다. 그러나 박테리아나 바이러스성 유전물질의 공장으로의 이동에 대한 우려는 식물 게놈의 기능적 등가물을 사용하여 외계종에서 식물로 유전물질이 전달되지 않도록 하는 세포내 벡터라는 벡터를 개발하게 되었다.[32]

식물 바이러스는 아그로박테리움 방법이 모든 식물에게 효과가 있는 것은 아니기 때문에 벡터로 사용될 수 있다. 식물 바이러스의 예로는 담배 모자이크 바이러스(TMV), 감자 바이러스 X, 카우페아 모자이크 바이러스가 있다.[33] 단백질은 바이러스의 코팅 단백질에 대한 융합으로 표현될 수 있으며, 조립된 바이러스 입자의 표면에 표시되거나, 식물 내에 축적되는 불용 단백질로 표시된다. 식물 벡터를 사용하는 식물에서의 표현은 종종 구성적이며,[34] 식물 표현 벡터에 일반적으로 사용되는 구성 촉진자는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 촉진자 이다.[35][36]

포유류

포유류 발현 벡터는 박테리아 발현 시스템보다 포유류 단백질의 발현에 상당한 이점을 제공한다. - 적절한 접힘, 변환 후 수정 및 관련 효소 활동. 또한 표현된 단백질이 올바른 글리코실레이션을 포함하지 않을 수 있는 다른 진핵 비-매머럴 시스템보다 더 바람직할 수 있다. 그것은 특히 적절한 접힘과 안정성을 위해 보호막을 필요로 하는 막 관련 단백질을 생산하는 데 유용하며, 변환 후 수 많은 수정을 포함하고 있다. 그러나 단점은 원핵 벡터에 비해 제품의 수율이 낮다는 점과 관련된 기술의 비용이 많이 드는 특성이다. 복잡한 기술, 포유류 세포 표현 동물 바이러스로 인한 잠재적 오염도 대규모 산업 생산에 제약을 받고 있다.[37]

중국 햄스터 난소(CHO), COS 등 배양된 포유류 세포 라인은 HEK, Hela 등 인간 세포 라인을 포함해 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 벡터는 세포로 전이되고 DNA는 안정적인 전이인 경우 호몰로 재조합에 의해 게놈에 통합되거나 세포가 일시적으로 전이될 수 있다. 포유류 표현 벡터의 예로는 아데노바이러스 벡터,[38] pSV 및 플라스미드 벡터의 pCMV 시리즈, 백신 및 레트로바이러스 벡터,[39] 바쿨로바이러스 등이 있다.[30] 시토메갈로바이러스(CMV)와 SV40의 촉진제는 일반적으로 포유류 발현 벡터에 유전자 발현을 유도하는 데 사용된다. 신장계수(EF)-1 프로모터와 같은 비바이러스계 프로모터도 알려져 있다.[40]

셀프리 시스템

전사와 번역에 필요한 세포 성분을 함유한 대장균 세포 리세이트가 이 시험관내 단백질 생산 방법에 사용된다. 이러한 체계의 장점은 단백질이 체내에서 생산되는 것보다 훨씬 빨리 생성될 수 있다는 것인데, 이는 세포를 배양하는 데 시간이 필요하지 않고, 또한 비용이 더 많이 들기 때문이다. 대장균 발현에 사용되는 벡터는 이 시스템에 사용할 수 있지만 이 시스템에 특별히 설계된 벡터도 사용할 수 있다. 진핵 세포 추출물은 다른 세포가 없는 시스템에서도 사용될 수 있다. 예를 들어 밀 배아 세포가 없는 표현 시스템이다.[41] 포유류 세포가 없는 시스템도 생산되었다.[42]

적용들

실험실용

표현 숙주의 표현 벡터는 이제 연구를 위한 단백질을 생산하기 위해 실험실에서 사용되는 일반적인 방법이다. 대부분의 단백질은 대장균에서 생성되지만 글리코실화 단백질과 이설화 결합을 가진 단백질은 효모, 바쿨로바이러스, 포유류 시스템을 사용할 수 있다.

펩타이드 및 단백질 의약품 생산

대부분의 단백질 의약품은 현재 표현 벡터를 이용한 재조합 DNA 기술을 통해 생산되고 있다. 이러한 펩타이드와 단백질 약물은 호르몬, 백신, 항생제, 항체, 효소일 수 있다.[43] 질병 관리에 사용되는 최초의 인간 재조합 단백질인 인슐린은 1982년에 도입되었다.[43] 생명공학은 이러한 펩타이드와 단백질 약품을 대량으로 생산할 수 있게 하는데, 그 중 일부는 이전에는 드물거나 얻기 어려웠던 것이다. 또한 숙주 바이러스, 독소, 프리온과 같은 오염물질의 위험도 줄인다. 과거의 예로는 성장 호르몬 뇌하수체 샘은 8세는 바이러스성 질병의 전송에 인간의 혈액에서 분리된 환자들 혈액 응고 인자에 dwarfism,[44]와 바이러스성 오염 물질 때문에 치료를 받고에 Creutzfeldt–Jakob이 병을 일으키인간의 시체들은에서 수확된 열로부터 추출되는에서 프리온 오염을 포함한다.로 간염과 에이즈.[45][46] 그러한 위험은 단백질이 인간이 아닌 숙주세포에서 생성될 때 완전히 감소하거나 제거된다.

유전자변형식물과 동물

최근 몇 년 동안, 표현 벡터는 유전자이전 생물을 생산하기 위해 식물과 동물에 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되어 왔다. 예를 들어 농업에서는 유전자이전 식물을 생산하기 위해 사용된다. 표현 벡터는 쌀에 비타민 A의 전구체인 베타 카로틴을 도입하기 위해 사용되어 왔다. 이 제품은 황금 쌀이라고 불린다. 이 과정은 또한 살충제를 생산하는 식물인 바실러스 튜링겐시스 독소 또는 변형된 유기체에 의해 생산되기 때문에 농가의 살충제 적용 필요성을 줄이는 BT 독소라는 유전자를 도입하는 데 사용되었다. 또한 표현 벡터는 토마토를 썩게 하는 화학물질을 적게 생산하도록 식물을 변화시킴으로써 토마토의 숙성을 연장하는데 사용된다.[47] 건강상의 위험을 알 수 없다는 점, 특정 유전자변형 식품작물에 대한 기업의 특허 가능성, 윤리적 우려 등을 이유로 표현 벡터를 사용해 농작물을 개조하는 것에 대한 논란이 있어왔다. 그럼에도 불구하고, 이 기술은 여전히 사용되고 있고 연구도 많이 되고 있다.

유전자이전 동물들도 동물의 생화학적 과정과 인간의 질병을 연구하기 위해 생산되거나, 의약품과 다른 단백질을 생산하는데 사용되었다. 그들은 또한 유리하거나 유용한 특성을 갖도록 설계될 수 있다. 녹색 형광 단백질은 때때로 형광 형광체를 만들 수 있는 동물로 만들어지는 태그로 사용되기도 하며, 이것은 형광 글루피쉬를 생산하기 위해 상업적으로 이용되어 왔다.

유전자 치료

주요 기사: 유전자 치료의 벡터

유전자 치료는 벡터가 운반하는 '정상' 유전자를 게놈에 삽입해 '비정상' 유전자를 대체하거나 특정 유전자의 발현을 보완하는 여러 질병에 대한 유망한 치료법이다. 바이러스 벡터는 일반적으로 사용되지만 다른 비바이러스 전달 방법이 개발되고 있다. 예를 들어 암을 유발할 수 있는 삽입형 돌연변이를 일으키는 등 부작용을 일으킬 수 있는 바이러스 벡터 때문에 치료는 여전히 위험한 선택이다.[48][49] 하지만, 유망한 결과들이 있었다.[50][51]

참고 항목

참조

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