콜로칼라이제이션

Colocalization

형광 현미경 검사에서, 콜로컬레이션은 서로 다른 "표적"이 세포의 동일한 영역에 위치하는지 또는 서로 매우 가까운 곳에 위치하는지 보기 위해 각각 별도의 방출 파장을 가진 두 개 이상의 서로 다른 형광 라벨 사이의 공간적 중첩을 관찰하는 것을 말한다.이 정의는 두 가지 다른 현상, 즉 같은 픽셀에 (아마도 관련이 없는) 두 개의 불소 형상의 존재와 생물학적 상호작용을 나타내는 불소 형상의 훨씬 중요한 통계적 관계인 상관관계로 나눌 수 있다.[1]이 기술은 생물 분자 쌍들 간의 관계를 증명하는 동안 많은 세포 생물학적 생리학적 연구에 중요하다.

역사

암스테르담 대학의 에릭 맨더스는 피어슨의 상관 계수를 현미경 연구자들에게 소개한 후,[2] "과대 계수" M1과 M2가 가장 인기 있고 유용한 것으로 판명된 다른 계수와 함께, 생물 분자 한 쌍 사이의 상관관계를 증명하는 능력을 크게 강화했다.[3][4]계수를 사용하는 목적은 영상의 중첩 정도, 보통 다른 방출 파장에서 기록된 다차원 현미경 영상의 두 채널의 특성을 파악하는 것이다.실베인 코스트스는 Pearson의 상관 계수를 M1과 M2가 요구하는 임계값을 객관적으로 설정하는 도구로 활용하면서 대중적인 접근법을 도입했다.[5]코스트 접근방식은 양의 상관관계만 관심이 있으며 PCC의 유용한 측정치를 제공하지 않는다고 가정한다.

계수를 사용하면 콜컬레이션 검출의 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있지만, 형광 투시 샘플이 어떻게 준비되었는지, 콜컬레이션이 적용된 영상이 어떻게 획득되고 처리되었는지 등 인자의 수에 따라 달라진다.연구는 매우 주의 깊게, 그리고 주의 깊게 배경지식을 한 후에 실시되어야 한다.현재 이 분야는 혼란에 시달리고 있으며 표준화된 접근방식은 아직 확고히 확립되어 있지 않다.[6]이를 시정하기 위한 시도는 일부 계수의 재점검 및 개정,[7][8] 소음 시정요인의 적용,[1] "콜로컬라이제이션의 정확한 측정을 위한 소음교정 상관관계 재현"[9] 및 추가 프로토콜 제안 등을 포함하며,[10] 이를 볼트와 코델리에레스(2006)가 철저히 검토하였다.[6]또한 형광 영상이 일정량의 초점이 맞지 않는 신호를 포함하고 있는 경향과 포아송 샷 및 기타 노이즈로 인해 정량화 전 사전 처리가 보통 필요하다.[11][12]디콘볼루션에 의한 세심한 영상 복원은 노이즈를 제거하고 영상의 대비를 증가시켜 콜로컬화 분석 결과의 품질을 향상시킨다.지금까지 콜로컬라이징을 정량화하기 위해 가장 자주 사용되는 방법은 두 개의 뚜렷한 현미경 채널에서 픽셀 강도의 통계적 상관관계를 계산한다.보다 최근의 연구는 이것이 서로 다른 세포 구획에 존재하는 것으로 알려진 표적에도 높은 상관 계수를 초래할 수 있다는 것을 보여주었다.[13]디지털 객체 인식, 면적 중복 계산 및 픽셀 강도 상관 값과의 결합을 통해 보다 강력한 콜로칼라화 정량화를 달성할 수 있다.이는 Pearson의 상관 계수를 객체 보정하는 개념으로 이어졌다.[13]

사용 예

일부 불침투성 형광 아연 염료는 검사한 네 가지 다른 조직 유형 중 세포의 세포탈취 및 괴사화 세포의 세포와 핵에 검출 가능한 라벨을 붙일 수 있다.즉 대뇌피질, 해마, 소뇌, 그리고 또한 아연 증가의 콜로칼화 검출과 잘 수용된 세포 사망 지표인 요오드화합물이 신장 세포에서도 발생한다는 것이 입증되었다.형광 콜로컬레이션의 원리를 사용한다.다세포 유형에서 아연 축적과 요오드화 프로피듐(전통 세포 사망 지표)의 동시 검출이 입증되었다.[14]신경과학 분야의 콜로컬라이제이션 계량화의 다양한 예는 리뷰에서 찾을 수 있다.[15]콜로칼리화 정량화에 관한 자세한 프로토콜은 책장에서 찾을 수 있다.[16]

단분자 분해능

콜로컬라이징은 형광 라벨로 표시된 분자 종들 간의 상호작용을 감지하기 위해 실시간 단일 분자 형광 현미경 검사에 사용된다.이 경우 한 종(예: DNA 분자)은 일반적으로 영상 표면에 고정되고 다른 종(예: DNA 결합 단백질)은 용액에 공급된다.이 두 종은 시각적으로 분해된 (>50 nm) 색의 염료(예: 시아닌-3 및 시아닌-5)로 표시되어 있다.형광 투과는 일반적으로 벌크 용액의 분자에 대한 표면의 분자에 대한 신호 대 잡음 비를 증가시키는 총 내부 반사 모드로 수행된다.분자는 표면에 실시간으로 나타나는 점으로 감지되며, 점-스프레드 기능을 장착해 위치가 10~20nm 이내임을 알 수 있다.전형적인 생체 분자의 크기는 10 nm의 순서로 되어 있기 때문에, 이 정밀도는 분자 상호작용을 부르기에 충분하다.

결과 해석

질적 및 정량적 콜로컬화 연구의 결과를 보다 잘 해석하기 위해, 콜로컬화 계수의 값에 묶인 다섯 가지 언어 변수 세트를, 이를 기술하는 데 매우 약하고 약하며 중간이고 강하며 매우 강한 것을 사용할 것을 제안하였다.접근방식은 퍼지 시스템 모델과 컴퓨터 시뮬레이션의 사용에 기초한다.새로운 계수가 도입되면 그 값을 세트에 적합시킬 수 있다.[18]

관련 기법

  • FRET: 10nm 근접
    • (경량 현미경 검사: 250nm 해상도만, 유효 상호작용의 확실성 없음)
  • 면역강수(IP) 드롭다운/풀다운
  • 효모 2 하이브리드 - 단백질 상호작용 매핑

벤치마크 이미지

형광 현미경 영상의 콜컬레이션 정도는 콜컬레이션의 사전 정의된 값을 가진 다운로드 가능한 이미지 세트의 무료 모음인 콜컬레이션 벤치마크 소스를 사용하여 검증할 수 있다.

소프트웨어 구현

오픈 소스

  • FIJI는 ImageJ에 불과함 - 배터리 포함
  • 바이오이미지 XD

폐쇄 출처

  • AxioVision Colocalization 모듈
  • 콜로컬라이제이션 연구 소프트웨어
  • 코로컬라이저 프로 코로컬라이저 프로
  • 니콘의 NIS-Elements Colocalization 모듈
  • Scientific Volume Imaging의 Huygens Colocalization Analyzer
  • 쿼럼 테크놀로지의 볼로시티
  • 미디어 사이버네틱스의 이미지-프로
  • 비트플레인의 이마리스
  • 아리비스 비전4d

참조

  1. ^ a b 애들러 외(2008)
  2. ^ 맨더스 외 연구진(1992)"S상 중 3차원 복제 패턴의 역학, DNA의 이중 라벨링과 콘포칼로컬 현미경 검사에 의한 분석." [1]
  3. ^ Manders; et al. (1993). "Measurement of co-localisation of objects in dual-colour confocal images". Journal of Microscopy. 169 (3): 375–382. doi:10.1111/j.1365-2818.1993.tb03313.x.
  4. ^ 진추크 V 외 연구진(2007)"다발성 concocal limonofluorscence 현미경 영상의 정량적 콜로컬레이션 분석: 생물학적 현상을 탐색하기 위해 픽셀을 밀어 넣는다."액타 히스토케미컬 사이토케미 40:101-111.
  5. ^ 코스테스 외 연구진(2004) "실시간 세포에서 단백질-단백질 코로칼화의 자동 및 정량적 측정" [2]
  6. ^ a b BOLTE와 CODELIERES(2006) "경량현미경에서 세포하초점해석 안내 여행" [3]
  7. ^ 애들러 및 파름드리드(2010)"상관 관계에 의한 콜로컬화 수량화:Pearson 상관 계수는 Mander의 중복 계수보다 우수하다. [4]
  8. ^ Krauß 외 연구진(2015)."하세포 구획 식별을 위한 형광 및 Raman 현미경 이미지의 콜로컬레이션: 검증 연구"분석가, 제140권 7, 2360-2368쪽[5]
  9. ^ Adler, J.; Pagakis, S. N.; Parmryd, I. (1 April 2008). "Replicate-based noise corrected correlation for accurate measurements of colocalization". Journal of Microscopy. 230 (1): 121–133. doi:10.1111/j.1365-2818.2008.01967.x. PMID 18387047.
  10. ^ Curr Protoc Cell Biol "concocal 형광 현미경 영상의 정량적 콜로컬레이션 분석"웨이백 머신에 보관된 2009-11-28
  11. ^ 폴리 JB (2006년).생물학적 콘포칼로리 현미경 지침서
  12. ^ 진추크 V 외(2011년)."단백질 근접지수 및 상관계수 추정치와 함께 강화된 배경감소를 이용한 형광표지의 공간 상관관계 수량화"Nat Protoc 6:1554-1567.
  13. ^ a b Moser, Bernhard; Hochreiter, Bernhard; Herbst, Ruth; Schmid, Johannes A. (2016-07-01). "Fluorescence colocalization microscopy analysis can be improved by combining object-recognition with pixel-intensity-correlation". Biotechnology Journal. 12 (1): 1600332. doi:10.1002/biot.201600332. ISSN 1860-7314. PMC 5244660. PMID 27420480.
  14. ^ Stork, Christian J.; Li, Yang V. (15 September 2006). "Measuring cell viability with membrane impermeable zinc fluorescent indicator". Journal of Neuroscience Methods. 155 (2): 180–186. doi:10.1016/j.jneumeth.2005.12.029. PMID 16466804.
  15. ^ 진추크 V&그로스엔바허-진추크 O(2009년)."정량적 콜로컬화 분석의 최근 발전:신경과학에 집중하라"고 말했다.프로그 히스토케미컬 사이토케미 44:125-172
  16. ^ "Adler J & Parmryd I (2013) Methods Mol Biol 931, 97-109". Colocalization analysis in fluorescence microscopy. Retrieved 2016-04-19.
  17. ^ Gelles, Friedman L. (17 February 2012). "Mechanism of Transcription Initiation at an Activator-Dependent Promoter Defined by Single-Molecule Observation". Cell. 148 (4): 635–637. doi:10.1016/j.cell.2012.01.018. PMC 3479156. PMID 22341441.
  18. ^ Zinchuk, V; et al. (2013). "Bridging the gap between qualitative and quantitative colocalization results in fluorescence microscopy studies". Sci Rep. 3: 1365. doi:10.1038/srep01365. PMC 3586700. PMID 23455567.