기능 클로닝

Functional cloning
기능 복제 실험에서 선택을 활용하기 위한 워크플로우입니다.여기서는 암피실린 내성을 제공하는 유전자만 선택된다.

기능성 복제는 유전자 식별을 [1][2][3]위해 암호화된 단백질의 배열이나 기능에 대한 사전 지식에 의존하는 분자 복제 기술이다.이 분석에서는 관심 단백질의 유전자 서열을 식별하기 위해 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다.발현 cDNA 라이브러리는 관심 단백질에 특정한 항체로 선별되거나 단백질 [1]기능을 통한 선택에 의존할 수 있다.역사적으로 단백질의 아미노산 배열을 이용해 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 준비했으며,[2][3] 이 올리고뉴클레오티드는 관심 단백질을 코드하는 유전자를 식별하기 위해 라이브러리에 대해 조사되었다.일단 관심 유전자를 가진 후보 클론이 확인되면, 그것들은 배열되고 그들의 신원이 확인된다.이 복제 방법은 연구자들이 유전자의 위치나 유전자 [1]배열에 대한 사전 지식 없이 전체 게놈을 검사할 수 있게 해준다.

이 기술은 한 유기체에서 다른 [4]유기체로 유사한 단백질을 코드하는 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다.마찬가지로, 이 기술은 메타게노믹 라이브러리와 짝을 지어 베타락타마아제 활성을 스크리닝하거나 [5]페니실린의 존재 하에서 성장을 선택함으로써 새로운 항생제의 식별과 같은 유사한 기능을 수행하는 새로운 유전자와 단백질을 식별할 수 있다.

실험 워크플로우

사카로미세스 세레비시아 숙주의 게놈 라이브러리.

기능 복제 실험의 흐름은 유전 물질의 출처, 관심 있는 단백질 또는 유전자에 대한 사전 지식의 범위, 그리고 단백질 기능을 선별하는 능력에 따라 달라집니다.일반적으로 기능 복제 실험은 1) 샘플 수집, 2) 라이브러리 준비, 3) 스크리닝 또는 선택, 4) 시퀀싱의 4단계로 구성됩니다.

샘플 수집

유전자 물질은 생물학적 질문에 관련된 특정 세포 유형, 생물 또는 환경 샘플로부터 수집된다.기능성 클로닝에서 mRNA는 일반적으로 분리되며, cDNA는 분리된 mRNA로부터 준비된다(RNA [6]추출).특정 상황에서는 게놈 DNA가 분리될 수 있으며, 특히 환경 샘플이 유전자 [1]물질의 소스로 사용될 경우 더욱 그러하다.

라이브러리 준비

참고 항목: 게놈 라이브러리 및 cDNA 라이브러리

시작물질이 게놈 DNA일 경우 DNA를 전단하여 선택한 벡터에 적합한 길이의 단편을 생성한다.그런 다음 DNA 조각 또는 cDNA는 제한 핵산 분해 효소로 처리되고 플라스미드 또는 염색체 벡터에 결합됩니다.단백질 또는 그 기능을 위해 해당 스크린을 측정할 경우 유전자 생성물이 발현되도록 하기 위해 발현 벡터를 사용한다.벡터의 선택은 적절한 발현을 보장하고 암호화된 유전자가 벡터의 삽입 [7]크기의 한계 내에 들어가는 것을 보장하기 위해 DNA 또는 cDNA의 기원에 의존할 것이다.

숙주의 선택은 코돈 사용이 기증 유기체와 유사함을 보장하기 위해 중요하다.숙주는 또한 발현된 [7]단백질의 적절한 기능을 가능하게 하기 위해 적절한 번역 후 수정과 단백질 접힘이 일어날 것을 보장할 필요가 있다.

심사 또는 선정

준비된 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 관심 유전자에 대해 스크리닝하는 방법은 실험 설계와 생물학적 질문에 따라 매우 가변적이다.스크리닝의 한 가지 방법은 쿼리 단백질의 [8]아미노산 배열로부터 제조된 퇴화 올리고뉴클레오티드로 서던 블로팅을 통해 콜로니를 프로브하는 것이다.본 발명의 발현 라이브러리에서는 웨스턴 블로팅을 통해 쿼리 단백질에 고유한 항체로 스크리닝하여 관심 유전자를 가진 콜로니를 동정함으로써 관심 단백질을 동정할 수 있다.다른 상황에서는 특정 분석을 사용하여 단백질의 [1]활성을 선별하거나 선택할 수 있습니다.예를 들어 특정 항생제를 [5]포함한 배지에서 라이브러리의 콜로니를 성장시킴으로써 항생제 내성을 부여하는 유전자를 선택할 수 있다.또 다른 예는 쉽게 시각화할 [9]수 있는 비색 화합물에 촉매되는 기질로 배양하여 효소 활성 스크리닝이다.

시퀀싱

참고 항목: DNA 배열 분석

기능성 클로닝의 마지막 단계는 스크린 또는 선택 단계에서 성공적으로 식별된 클론으로부터 DNA 또는 cDNA를 배열하는 것입니다.그런 다음 이 시퀀스에 주석을 달아 산업용 단백질 [10]발현 및 정제 같은 다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다.

이점

기능성 클로닝의 장점은 배양할 수 없는 유기체, 특히 박테리아나 바이러스 [1]표본에서 원하는 적용으로 새로운 유전자를 선별할 수 있는 능력을 포함한다.또한 단백질 기능만을 선별할 수 있어 배열 유사성이 낮을 때 관련 기능을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 동정할 수 있다.기능성 클로닝은 유기체의 게놈 배열이나 게놈 [1]내 유전자의 위치에 대한 사전 지식 없이 유전자 식별을 가능하게 한다.

제한 사항

다른 복제 기술과 마찬가지로, 벡터와 숙주 선택은 복제 편향으로 인한 기능적 복제를 통한 유전자 식별의 성공에 영향을 미친다.벡터는 발현된 단백질의 전체 DNA 서열을 수용하는 삽입 크기를 가져야 합니다.또한 표현 벡터에서 프로모터와 터미네이터는 선택된 숙주 유기체 내에서 기능해야 합니다.호스트의 선택은,[7][1] 코돈의 사용법, 문자 변환과 번역의 기계, 또는 호스트내의 번역 후의 변경에 의해서, 문자 변환과 번역에 영향을 주는 경우가 있습니다.

그 외의 제한 사항으로는, 많은 노동력을 필요로 하는 라이브러리 준비 작업이나, 고비용과 시간이 [7]걸리는 스크린이 있습니다.

대체 어프로치

위치 복제

최적의 클로닝 전략을 결정하기 위한 흐름도.

위치 복제는 관심 있는 유전자의 식별을 위한 또 다른 분자 복제 기술이다.이 방법은 유전자 [11]식별을 유도하기 위해 기능 대신 정확한 염색체 위치를 사용한다.이 때문에 이 방법은 염색체 궤적에 있는 모든 유전 물질에 초점을 맞추고 기능에 [11]대한 가정을 하지 않는다.마우스나 효모 등의 모델 유기체에서는 대상 유전자의 위치에 관한 정보를 배열된 게놈에서 얻을 수 있기 때문에 이 방법이 더 자주 사용된다.그러나 시퀀스 정보를 사용할 수 없는 경우에는 이 방법이 훨씬 더 복잡해집니다.이 경우 연계 분석을 [11]사용할 수도 있습니다.반면에 기능 복제는 생존 가능하지만 배양할 수 없는 세균 병원균과 같은 유기체에 더 쉽게 사용되고 배열 데이터를 이용할 수 없지만 유전자 호몰로지 또는 단백질 기능이 여전히 [11]관심 있는 경우이다.

기능성 클로닝과 위치성 클로닝을 구별하는 방법은 유전자를 단어로 시각화하는 것이다.기능성 복제는 동의어를 사용하여 단어를 찾아보고 동일한 의미(또는 기능)[12]를 가진 새로운 단어를 선택하는 것과 같습니다.위치 복제는 사전의 특정 페이지를 선택한 다음 해당 페이지만 검색하여 [12]관심 단어를 찾는 것과 같습니다.

호몰로지를 계산적으로 결정하다

배열 기술이 점점 더 저렴해짐에 따라, 이제 알려지지 않은 게놈을 배열하고 [13]선별하는 대신 컴퓨터적으로 호몰로지를 결정하는 것이 더 실현 가능하게 되었다.이것은 동시에 관심 있는 여러 유전자를 선별할 수 있다는 추가적인 이점을 가져오고 실험 시간을 단축합니다.또한 노동 집약적인 복제 절차도 피할 수 있습니다.[14]그러나 이 경로를 택한다면 고려해야 할 다른 편견과 장애물이 있다.배열된 데이터를 이용하면 호몰로지만으로 [1]스크리닝이 가능하다.따라서 기능 기반 접근방식은 DNA 배열만으로는 [1]기능을 예측할 수 없는 새로운 효소의 발견을 가능하게 한다.따라서 시퀀싱은 실험적으로 노동집약적이지 않지만, 관련된 기능의 유전자의 배열 호몰로지가 다르기 때문에 관심있는 유전자의 누락으로 이어질 수 있다.

깁슨 조립체

깁슨 어셈블리는 5' 엑소뉴클레아제, 중합효소, 리가아제 [15]등 세 가지 주요 효소를 사용하는 빠른 복제 방법입니다.엑소핵산가수분해효소는 3'[15] 돌출부를 남기고 DNA 조각의 5' 끝을 소화한다.DNA 삽입의 양 끝에 유의한 호몰로지(20-40bp)가 있는 경우, [15]상보적인 골격으로 아닐할 수 있습니다.그 후, 중합효소는 [15]그 틈새를 메우고, 연결효소는 끝부분의 틈새를 융합할 수 있다.이 방법은 복제 속도와 [15]벡터 백본으로의 복제 성공률을 크게 높인다.그러나, 그것은 DNA 조각이 [15]플라스미드와 유의한 상동성을 가지도록 요구한다.따라서 클론되는 시퀀스에 대한 지식을 미리 알고 있어야 합니다.이것은 기능 클로닝의 요건이 아닙니다.

TOPO 클로닝

TOPO 클로닝은 Taq 중합효소를 [16]이용한 복제 방식이다.이는 Taq가 PCR 반응 [16]생성물의 3' 말단에 단일 아데노신 돌출부를 남기기 때문이다.이 지식을 활용하여 5' 티민 돌출부가 있는 등뼈를 복제 [16]목적으로 사용할 수 있습니다.이 경우 클론 중인 fragment에 대한 지식은 PCR 프라이머를 만들 수 있으며 TOPIx Cloning 호환 벡터의 수는 비교적 적어야 합니다.단, 리액션은 [16]5분 정도밖에 걸리지 않는다는 장점이 있습니다.

게이트웨이 재결합 클로닝

게이트웨이 재조합 복제는 DNA 조각이 하나의 플라스미드 백본에서 하나의 상동 재조합 이벤트를 통해 다른 [17]백본으로 이동하는 복제 방법입니다.그러나 이 방법이 작동하려면 관심 DNA 조각이 재조합 [17]부위에 의해 측면으로 배치되어야 합니다.이 방법이 엄밀하게는 다른 방법은 아니지만, 완전히 새로운 게놈 라이브러리를 만드는 것보다 한 플라스미드에서 다른 플라스미드로 DNA 조각의 이동을 가능하게 한다.이 방법이 기능성 클로닝과 함께 사용될 수 있는 이유는 라이브러리를 다른 프로모터 아래에 두거나 다른 선택 [17]마커를 가진 백본 위에 두기 위해서이다.이것은 코돈 [17][7]편향으로 이 문제와 싸우기 위해 광범위한 박테리아에서 기능성 복제를 시도하고 싶다면 유용할 수 있다.

적용들

환경 내 호몰로지 결정

메타제노믹스는 기능성 복제를 일반적으로 사용하는 가장 큰 분야 중 하나입니다.메타제노믹스는 내장 마이크로바이옴이나 호수수와 [1]같은 특정 환경 샘플로부터 모든 유전 물질을 연구합니다.환경의 [1]DNA 조각이 포함된 기능 라이브러리가 생성됩니다.DNA 배열이 유래한 원세균은 쉽게 검출할 수 없기 때문에 메타제노믹 기능 라이브러리를 작성하는 것이 유리하다.실험실에서 배양하기 쉬운 세균은 1% 미만이어서 [18]배양할 수 없는 세균이 많다.기능성 라이브러리를 이용함으로써 배양 불가능한 박테리아의 유전자 기능을 [1]연구할 수 있다.게다가, 이러한 배양되지 않은 미생물들은 생명공학적인 응용을 가진 새로운 효소의 발견을 위한 원천을 제공한다.해양 환경에서 발견된 몇몇 새로운 단백질은 단백질 분해효소, 아밀라아제, 리파아제, 키티나아제, 디옥시리보핵산가수분해효소,[19] 포스파타아제 등의 효소를 포함한다.

알려진 종의 상동성 결정

안되니까 만약 한가지 소스에서 유전자를 homolog 다른 유기체에 존재한다를 결정하는 것이 시급하다 상황이 있다.예를 들어 중합 효소 연쇄 반응에 대해, 새로운 DNA식별 polymerases는 그 기초는 deoxyribonucleotides에서 DNA분자를 통합하(PCR)반응이다.[20]반면 인간의 중합 효소가 최적으로 37°C(98.6 °F)에서 일한다, DNA94–98 °C(201–208 °F)까지를 가지지 않는다.[20]이것은 인간의 DNA중합 효소는 PCR반응으로 나타나는non-functioning 중합 효소 단백질과 실패한 PCR의 결과를 가져올denaturation 단계 동안을 가진 이러한 온도에서 등의 문제를 제기하고 있다.높은 온도에서 자라는 thermophile 박테리아나에서 정한 것이 DNA중합 효소를 소탕하기 위해서, 사용될 수 있다.는 고온성 세균 Thermus aquaticus에서 나온다 예를 들면 Taq중합 효소.[20]하나는 높은 온도에서 내열성이 추가된 이점을 가지고 있는 상동 polymerases는 그 기초를 찾기 위해 주는 기능성 복제 화면 구성할 수 있습니다.

이것을 염두에 두고, 3173 중합 효소, 다른 중합 효소 효소, 지금 일반적으로 RT-PCR 반응에 사용되는 위의 이론을 이용한 발견되었다.[21]RT-PCR 반응에서 2개의 각각의 효소 일반적으로 사용된다.첫째는 레트로 바이러스의 역 역전사 효소 cDNA.[21]에 RNA변환할입니다.두번째는 내열성 DNA중합 효소는 목표 배열을 증대시키는 데.[21]3173 중합 효소는 효소의 기능 RT-PCR.[21]에게 더 좋은 옵션 결과를 수행할 수 있다.그 효소가 바이러스에 호스트는 원래 문어 온천(93°C)에 옐로 스톤 국립 공원에서 발견된 기능적 복제를 통해 발견되었다.[21]

인체 건강 응용 프로그램

어느 세균 감염을 치료하는 지속적인 도전의 환자들이며, 따라서 박테리아 항생제에 시간이 지남에 따라 저항하게 해 주는 약물 치료에 전적인 치료 복용하지 않아 일반적으로 발생하면 항생제 내성.[22]어떻게 항생제 내성과 싸우기 위해 이해하려면 어떻게 그 박테리아 게놈과 건강한 사람들의 항생제를 어떤 최근의 사용 기본 제공하기 위해 변화 발전하고 있다는 이해하는 게 중요하다[22]주는 기능성cloning-based 기술을 이용 DNA인간의 미소 식물상 대장 균에 표현 벡터로 복제되었다에서 고립시켰다.[22]그 후 항생제를 스크린으로 [22]도포했다.플라스미드가 항생제 내성을 제공하는 유전자 삽입물을 포함하면 세포는 살아남아 플레이트에서 [22]선택되었다.삽입물이 저항을 제공하지 않으면 세포가 죽어서 [22]군집을 형성하지 못했습니다.살아남은 세포 군체의 선택에 기초하여 항생제 내성에 기여하는 유전적 요인들에 대한 더 나은 그림을 함께 결합했다.지금까지 확인된 저항 유전자의 대부분은 알려지지 [22]않았다.기능성 클로닝 기반의 기술을 사용함으로써 항생제 내성을 일으키는 유전자를 밝혀내 세균 감염에 대한 치료법을 더 잘 이해할 수 있다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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