높은 스루풋 스크리닝

High-throughput screening
하이 스루풋 스크리닝 로봇

HTS(High-Throughput Screening)는 특히 약물 발견에 사용되며 생물학, 재료[1] 과학 및 [2][3]화학 분야와 관련된 과학 실험 방법입니다.로봇 공학, 데이터 처리/제어 소프트웨어, 액체 처리 장치 및 민감한 검출기를 사용하여 높은 처리량 스크리닝을 통해 연구자는 수백만 건의 화학, 유전자 또는 약리학적 테스트를 신속하게 수행할 수 있습니다.이 과정을 통해 특정 생체 분자 경로를 조절하는 활성 화합물, 항체 또는 유전자를 빠르게 인식할 수 있다.이러한 실험 결과는 약물 설계와 특정 위치의 비상호작용 또는 역할을 이해하기 위한 출발점을 제공한다.

검사판 준비

로봇 암이 검사 플레이트를 처리합니다.

HTS의 핵심 실험실 또는 테스트 용기는 마이크로타이터 플레이트입니다. 마이크로타이터 플레이트는 보통 일회용 플라스틱으로 만들어지며, 우물이라고 불리는 작고 열린 칸막이가 특징입니다.일반적으로 HTS용 마이크로플레이트에는 96, 192, 384, 1536, 3456 또는 6144개의 웰이 있습니다.모두 96의 배수이며, 8 x 12의 간격과 9mm의 간격이 있는 원래의 96웰 마이크로 플레이트를 반영합니다.대부분의 웰에는 실험의 성격에 따라 테스트 항목이 포함되어 있습니다.예를 들어 디메틸 술폭시드(DMSO) 수용액에 용해된 다른 화합물일 수 있습니다.그 우물들은 또한 어떤 종류의 세포나 효소를 포함할 수 있다.(다른 웰은 실험용 콘트롤로 사용하기 위해 비어 있거나 순수한 용제 또는 처리되지 않은 샘플이 포함되어 있을 수 있습니다.

스크리닝 시설에는 일반적으로 내용물이 주의 깊게 목록화되어 있으며, 각각 연구소에서 작성했거나 상업적인 소스로부터 입수할 수 있는 스톡 플레이트의 라이브러리가 있습니다.이러한 스톡 플레이트 자체는 실험에 직접 사용되지 않습니다. 대신 필요에 따라 별도의 검사 플레이트를 만듭니다.어세이 플레이트는 단순히 스톡 플레이트의 복사본으로, 스톡 플레이트의 웰에서 완전히 비어 있는 플레이트의 해당 웰로 소량의 액체(종종 나노리터로 측정됨)를 피펫하여 생성됩니다.

반응 관찰

검사를 준비하기 위해, 연구자는 접시의 각 우물을 단백질, 세포 또는 동물 배아와 같이 실험을 수행하고자 하는 생물학적 실체로 채웁니다.생물학적 물질이 웰의 화합물과 흡착, 결합 또는 반응(또는 반응 실패)할 수 있도록 배양 시간이 경과한 후, 수동으로 또는 기계로 플레이트의 모든 웰에서 측정을 수행합니다.연구자가 현미경을 사용하여 우물 화합물에 의한 배아 발육의 변화나 결함을 찾고 컴퓨터가 스스로 쉽게 판단할 수 없는 효과를 찾을 때 수동 측정은 종종 필요합니다.그렇지 않으면 특수 자동 분석 기계가 웰에서 여러 가지 실험을 실행할 수 있습니다(예를 들어, 웰에 편광 빛을 비추고 반사율을 측정하는 것). 이는 단백질 결합의 지표가 될 수 있습니다.이 경우 기계는 각 실험의 결과를 하나의 웰에서 얻은 값에 대한 각 숫자의 매핑과 함께 숫자 값의 그리드로 출력합니다.대용량 분석 기계는 이렇게 몇 분 안에 수십 개의 플레이트를 측정할 수 있으며 수천 개의 실험 데이터를 매우 빠르게 생성합니다.

이 첫 번째 분석 결과에 따라, 연구자는 흥미로운 결과("히트"로 알려진 소스 웰의 액체를 새 분석 플레이트로 "체리픽"한 후 실험을 다시 실행하여 좁혀진 이 세트에 대한 추가 데이터를 수집하고 관찰 결과를 확인하고 정제함으로써 동일한 화면 내에서 추적 분석을 수행할 수 있습니다.

자동화 시스템

대용량 저장 및 고속 액세스를 위해 검사 플레이트를 저장하는 회전목마 시스템

자동화는 HTS의 유용성에 필수적인 요소입니다.일반적으로 하나 이상의 로봇으로 구성된 통합 로봇 시스템은 검체 및 시약 추가, 혼합, 배양, 최종 판독 또는 검출을 위해 스테이션 간에 검사 마이크로플레이트를 전송합니다.HTS 시스템은 일반적으로 많은 플레이트를 동시에 준비, 배양 및 분석할 수 있으므로 데이터 수집 프로세스가 더욱 빨라집니다.현재 하루에 최대 10만 개의 화합물을 테스트할 수 있는 HTS 로봇이 존재한다.[4][5]자동 콜로니 피커는 높은 처리량 유전자 [6]검사를 위해 수천 개의 미생물 콜로니를 선택합니다.uHTS 또는 초고 스루풋 스크리닝이라는 용어는 [7](2008년경) 하루에 100,000개 이상의 화합물을 스크리닝하는 것을 말한다.

실험 설계 및 데이터 분석

다양한 화합물 활성 화합물을 확인할( 작은 분자 또는 siRNAs 같은)의 급격한 심사의 능력으로 에이치 티에스 데이터의률이 최근 몇년에 발생한 폭발로 이어졌다 결과적으로, 에이치 티에스 실험에서 가장 근본적인 도전 과제의 생화학적 중요성 정보의 번째에 의존한 고분들에서 수집하는 것이다 .[8].edHTS 연구는 [9]Applied Proteomics, Inc.의 최고 과학 책임자 John Blume에 의해 다음과 같이 기술된 분야 중 하나입니다.곧, 만약 과학자가 몇 가지 통계나 기초적인 데이터 처리 기술을 이해하지 못한다면, 그 혹은 그녀는 진정한 분자 생물학자로 여겨지지 않을 것이고, 따라서 단순히 "공룡"[10]이 될 것이다.

품질 관리

고품질 HTS 측정은 HTS 실험에서 매우 중요합니다.고품질 HTS 분석의 개발에는 품질 관리(QC)를 위한 실험 및 계산 접근법의 통합이 필요하다.QC의 세 가지 중요한 수단은 (i) 좋은 플레이트 설계, (ii) 효과적인 양성 및 음성 화학/생물학적 대조군의 선택, (ii) 데이터 품질이 낮은 분석을 식별할 수 있도록 분화의 정도를 측정하는 효과적인 QC 지표의 개발이다.[11] 적절한 플레이트 설계는 시스템 오류(특히 웰 위치와 연결된 오류)를 식별하고 QC 및 히트 [9]선택에 대한 시스템 오류의 영향을 제거/저감하기 위해 사용해야 하는 정규화를 결정하는 데 도움이 됩니다.

효과적인 분석 QC 방법은 우수한 품질 평가를 위한 게이트키퍼 역할을 합니다.전형적인 HTS 실험에서 양성 대조군과 음성 대조군과 같은 음성 기준 사이의 명확한 구별은 좋은 품질의 지표이다.긍정적인 대조군과 부정적인 기준 사이의 차별화 정도를 측정하기 위해 많은 품질 평가 척도가 제안되었다.데이터 품질을 평가하기 위해 신호 대 배경비, 신호 대 잡음비, 신호 창, 측정 변동비 및 Z 계수가 채택되었습니다.[9] [12] 최근 HTS 평가의 데이터 품질 평가를 위해 엄격하게 표준화된 평균 차이(SSMD)가 제안되었다.[13] [14]

히트 선택

HTS에서 원하는 크기의 효과를 가진 화합물을 히트라고 합니다.히트를 선택하는 과정을 히트 선택이라고 합니다.복제품이 없는 화면(일반적으로 기본 화면)에서 히트 선택을 위한 분석 방법은 복제품이 있는 화면(일반적으로 확인 화면)과 다르다.예를 들어, z-점수 방법은 반복실험이 없는 화면에 적합하며, t-통계 방법은 반복실험이 있는 화면에 적합합니다.리플리케이션이 없는 화면의 SSMD 계산도 [9]리플리케이션이 있는 화면의 계산과 다릅니다.

반복실험이 없는 기본 화면에서 히트 선택을 할 경우 쉽게 해석할 수 있는 것은 평균 폴드 변화, 평균 차이, 억제율 및 활동 비율입니다.그러나 데이터 변동성은 효과적으로 캡처되지 않습니다.z 점수 방법 또는 SSMD: 모든 화합물이 화면의 음의 참조와 동일한 변동성을 갖는다는 가정에 기반하여 데이터 변동성을 캡처할 수 있습니다.[15][16] 그러나 특이치는 HTS 실험에서 흔히 볼 수 있으며 z-점수와 같은 방법은 특이치에 민감하여 문제가 될 수 있습니다.그 결과 히트 선택을 [5]위해 z*점수법, SSMD*, B점수법 및 분위수 기반법과 같은 강력한 방법이 제안되고 채택되었다.[9] [17] [18]

반복실험이 있는 화면에서는 각 화합물의 변동성을 직접 추정할 수 있습니다. 따라서 z-점수와 z*점수가 의존하는 강력한 가정에 의존하지 않는 SSMD 또는 t-통계량을 사용해야 합니다.t-통계량 및 관련 p-값을 사용할 때의 한 가지 문제는 표본 크기와 효과 [19]크기에 모두 영향을 받는다는 것입니다.평균 차이가 없는 검정에서 추출되므로 복합 효과의 크기를 측정하도록 설계되지 않았습니다.히트 선택의 경우 주요 관심사는 테스트된 화합물의 효과 크기입니다.SSMD는 [20]효과의 크기를 직접 평가합니다.SSMD는 또한 일반적으로 사용되는 다른 [21]효과 크기보다 나은 것으로 나타났다.SSMD의 모집단 값은 여러 실험에 걸쳐 비교 가능하며, 따라서 [22]복합 효과의 크기를 측정하기 위해 SSMD의 모집단 값에 동일한 컷오프를 사용할 수 있습니다.

스루풋과 효율을 높이는 기술

하나 이상의 플레이트에 걸친 화합물의 고유한 분포를 사용하여 플레이트당 측정 횟수를 늘리거나 측정 결과의 분산을 줄이거나 둘 다 줄일 수 있습니다.이 접근법의 단순화된 가정은 동일한 웰의 N개 화합물은 일반적으로 실제 적중물을 탐지하는 검사의 능력을 근본적으로 바꾸는 방식으로 서로 또는 검사 대상과 상호작용하지 않는다는 것이다.

예를 들어 화합물 A가 우물 1-2-3에, 화합물 B가 우물 2-3-4에, 화합물 C가 우물 3-4-5에 있는 플레이트를 상상해 보십시오.특정 표적에 대한 이 판의 분석에서 웰 2, 3, 4가 히트하면 화합물 B가 가장 가능성이 높은 약제임을 나타내는 동시에 특정 표적에 대한 화합물 B의 유효성에 대한 세 가지 측정을 제공할 수 있습니다.이 접근방식의 상업적 적용에는 스크리닝 대상 화합물 쌍 간의 간섭 가능성을 줄이기 위해 두 화합물이 둘 이상의 웰을 공유하지 않는 조합이 포함된다.

최근의 진보

NIH Chemical Genomics Center(NCGC)의 과학자들은 각 화합물에 대한 완전한 농도-반응 관계 생성을 통해 대규모 화학 라이브러리를 약리학적으로 프로파일링하는 패러다임인 정량적 HTS(qHTS)를 개발하기 위해 자동화 및 저용량 분석 형식을 활용했다.함께 제공되는 곡선 피팅 및 화학 정보학 소프트웨어 qHTS 데이터는 전체 라이브러리에 대한 절반의 최대 유효 농도(EC50), 최대 응답, 힐 계수(nH)를 산출하여 초기 구조 활동 관계([23]SAR)의 평가를 가능하게 한다.

2010년 3월에는 드롭 기반 미세유체학을 [23]사용하는 기존 기술보다 100만분의 1의 비용(10시간 동안−7 1억 번의 반응)으로 1,000배 빠른 스크리닝이 가능한 HTS 프로세스를 입증하는 연구가 발표되었습니다.오일로 분리된 유체 방울은 마이크로플레이트 웰을 대체하며, 시약이 채널을 통과하는 동안 분석 및 히트 정렬이 가능합니다.

2010년, 연구원들은 마이크로 유체 어레이 위에 놓일 수 있는 실리콘 렌즈 시트를 개발하여 64개의 다른 출력 채널의 형광을 카메라 [24]하나로 동시에 측정할 수 있게 했다.이 프로세스에서는 초당 200,000 드롭을 분석할 수 있습니다.

2013년 연구자들은 식물의 작은 분자에 대한 접근 방식을 공개했다.일반적으로 약물 발견 과정 초기에 고품질 개념 증명 검증을 제공하는 것이 필수적이다.이 경우, 의약품 개발을 위해 추가적인 최적화가 필요한 경우에도 유효하고 선택적이며 생물학적으로 이용 가능한 화학 탐침의 식별을 가능하게 하는 기술은 매우 중요하다.강력하고 생물학적으로 이용 가능한 작용제를 식별하기 위해 10년 이상 표적화된 단백질인 핵수용체 RORα가 매우 어려운 약물 표적의 예시로 사용되었다.종 모양의 곡선으로 인해 선별 단계에서 타격이 확인됩니다.이 방법은 정량적 HTS 방법(스크리닝과 히트 확인을 동시에)과 매우 유사하지만, 이 방법을 사용하면 데이터 포인트 수를 크게 줄일 수 있고 10만 개 이상의 생물학적 [25]관련 화합물을 쉽게 스크리닝할 수 있다.

전통적인 HTS 약물 발견이 정제된 단백질이나 온전한 세포를 사용하는 경우, 최근의 기술 개발은 선충류인 케노하브디티스 [26]엘레건과 제브라피쉬와 같은 온전한 생물체의 사용과 관련이 있다.

2016-2018년 플레이트 제조업체는 유기체 및 구상체 등의 3D 조직에서의 암 약물 발견을 다루기 위한 HTS 어메이션(hamenable assay)의 신속한 개발을 촉진하기 위해 초저밀착 세포 기피 표면을 대량 생산할 수 있는 전문 화학 제품을 생산하기 시작했습니다. 이는 보다 생리적으로 관련성이 [27][28][29]높은 형태입니다.

생물의학 연구를 위한 학계의 HTS 활용도 증대

HTS는 로봇 공학 및 고속 컴퓨터 기술의 현대적 진보를 통해 실현 가능한 비교적 최근의 혁신입니다.HTS 운영을 위해서는 여전히 고도로 전문화되고 비싼 스크리닝 랩이 필요하기 때문에, 중소 규모의 연구기관에서는 HTS 시설을 자체적으로 설치하는 것이 아니라 기존 HTS 시설의 서비스를 이용하는 경우가 많습니다.

학계에서는 대학이 독자적으로 [30]약품을 발굴하는 경향이 있다.일반적으로 산업에서만 볼 수 있는 이러한 시설은 대학에서도 점점 더 많이 볼 수 있게 되었다.예를 들어 UCLA는 HTS 실험실 분자 스크리닝 공유 리소스(MSSR, UCLA)에 대한 개방형 액세스 기능을 갖추고 있으며, 매일 100,000개 이상의 화합물을 선별할 수 있습니다.오픈 액세스 정책에 의해, 전 세계의 연구자가, 장기간에 걸친 지적 재산권 교섭을 실시하지 않고, 이 시설을 이용할 수 있게 됩니다.200,000개 이상의 작은 분자로 이루어진 복합 라이브러리를 갖춘 MSSR은 서부 해안의 모든 대학 중 가장 큰 복합 데크를 가지고 있습니다.또한, MSSR은 작은 분자 노력을 보완하는 완전한 기능적 유전체 기능(게놈 와이드 siRNA, shRNA, cDNA 및 CRISPR)을 특징으로 한다.기능성 유전체학은 HTS 능력을 활용하여 각각의 유전자를 녹아웃시키거나 과도하게 발현시킴으로써 관심의 맥락에서 각 유전자의 기능을 검사하는 게놈 와이드 스크린을 실행한다.높은 처리량 소분자 스크린과 게놈 와이드 스크린에 대한 병렬접속을 통해 연구자는 특정 질병 또는 소분자에 대한 행동 결정 모드를 대상으로 식별 및 검증할 수 있습니다.가장 정확한 결과는 "배열된" 기능 유전체 라이브러리를 사용하여 얻을 수 있습니다. 즉, 각 라이브러리는 단일 siRNA 또는 cDNA와 같은 단일 구조를 포함합니다.기능성 유전체학은 전형적으로 에피 형광 현미경 검사 또는 레이저 스캔 세포측정법을 사용한 고함량 선별과 짝을 이룬다.

일리노이 대학도 미네소타 대학과 마찬가지로 HTS를 위한 시설을 갖추고 있습니다.미시간 대학의 생명과학 연구소에는 화학 유전체학 센터에 HTS 시설이 있습니다.컬럼비아 대학교는 생화학, 세포 기반 및 NGS 기반 스크리닝에 사용할 수 있는 약 30만 개의 다양한 소분자와 약 10,000개의 알려진 생체 활성 화합물을 가진 HTS 공유 자원 시설을 가지고 있습니다.Rockefeller University에는 오픈 액세스 HTSRC(The Rockefeller University, HTSRC)의 HTS Resource Center(HTSRC)가 있으며, 이 센터는 38만 개 이상의 컴파운드 라이브러리를 제공합니다.Northwestern University의 High Throughput Analysis Laboratory는 표적 식별, 검증, 분석 개발 및 복합 스크리닝을 지원합니다.비영리 단체인 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute는 또한 MLPCN의 일부였던 Conrad Prebys Center for Chemical Genomics에 오랫동안 HTS 시설을 보유하고 있습니다.비영리 Scripps Research Molecular Screening Center(SRMC)[31]는 포스트 MLPCN 시대에 걸쳐 학계에 계속 봉사하고 있습니다.SRSC uHTS 시설은 학계에서 가장 큰 도서관 소장품 중 하나를 관리하고 있으며, 현재 66만 5천 개 이상의 소분자 실체에 있으며, 다중 PI 보조금 이니셔티브를 지원하기 위해 전체 소장품 또는 하위 도서관을 정기적으로 스크리닝한다.

미국에서는 국립 보건 연구원 또는 보건원small-molecule 심사 센터를 전국적으로 컨소시엄이 생물학적 연구에서 사용할 혁신적인 화학적 도구들을 제작하도록 만들었습니다.그 분자 도서관 탐촉자 생산 센터 네트워크 또는 MLPCN, assays 연구 단체에 의해, 작은 분자는 중앙 분자 리포지토리에 가입되어 있음을 큰 도서관에 제공해 에이치 티에스를 수행한다.

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