하이브리드화 분석

Hybridization assay

혼합 분석은 모든 형태의 정량화 혼합, 즉 핵산 혼합이라고 알려진 두 개의 보완적 핵산의 정량적 아닐링으로 구성된다.[1]

개요

생화학 및 약물 개발의 맥락에서 복합화 분석은 생물학적 매트릭스에서 핵산을 정량화하는 데 사용되는 리간드 결합 분석(LBA)의 일종이다. 혼합 측정은 96 웰 플레이트 또는 라벨이 부착된 비드와 같은 견고한 지지대에 있거나 솔루션에 있을 수 있다.

혼합 분석은 라벨링되지 않은 핵산 분자의 복잡한 혼합물 내에서 관련 DNA 또는 RNA 분자(즉, 시퀀스 유사성이 상당히 높은)를 식별하기 위한 라벨링된 핵산 탐침을 포함한다. 항이센스 요법, siRNA 및 기타 올리고뉴클레오티드 및 핵산 기반 생물요오드화 요법을 혼합 분석으로 정량화할 수 있다.

잡종화 방법의 신호는 포획 및 검출 항체에 동질적으로 작용하는 하펜스 및 소분자 리간드로 합성 시 수정된 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 수행할 수 있다. 기존 ELISA와 마찬가지로 말무 과산화효소(HRP) 또는 알칼리성 인산염(AP)에 대한 결합을 2차 항체로 사용할 수 있다.

샌드위치 혼합 검사

샌드위치 혼합 검사

샌드위치 하이브리드화 ELISA 검사 형식에서 ELISA의 항원 리간드와 항체는 핵산 분석 물질, 보완적인 올리고뉴클레오티드 포획 및 검출 탐사로 대체된다.[2]

일반적으로 핵산 혼합의 경우 일반적으로 결합 및 세척 단계(PBS 또는 TBS)에 대해 소금 농도를 고정하는 기존 ELISA와는 달리 혼합 및 세척 끈적임에 대해 단발성 소금 농도와 온도를 제어한다. 따라서 혼합 측정에서 최적의 염분 농도는 분석 물질, 캡처 및 검출 프로브의 길이와 기본 구성에 따라 달라진다.

경쟁력 있는 하이브리드화 평가

경쟁적 혼합 분석은[3] 전통적인 경쟁적 면역 분석과 유사하다. 다른 잡종화 분석과 마찬가지로, 포획 탐침은 분석 물질과 추적자 사이에 경쟁하는 상호보완성에 의존하며, 여기서 포획 탐침은 분석 물질과 유사하다고 명명된 올리고뉴클레오티드(Olgonucleotide)이다.

하이브리드화-레이그먼트 검사

하이브리드화-레이징 검사에서[4][5] 템플릿 프로브는 샌드위치 검사의 캡처 프로브를 대체하여 솔리드 서포트로 고정한다. 템플릿 탐침은 올리고뉴클레오티드 분석 물질과 완전히 보완되며 T4 DNA 리가아제 매개 레깅의 기질 역할을 하기 위한 것이다. 템플릿 프로브에는 레그 프로브가 분석 물질의 3'-끝에 래그할 수 있도록 레그 프로브를 보완하는 추가적인 스트레치가 있다. 일반적이긴 하지만, 레그 탐침은 예를 들어 다운스트림 신호 전달을 위한 digoxigenin으로 라벨을 표시한다는 점에서 탐지 탐침과 유사하다. 소금 세척이 엄격하고 낮거나 하지 않으면 비필수 제품이 제거된다.

예를 들어, 3' 대사물 N-1 버전의 분석물에 대해 발생할 수 있는 팽창 루프에 비해 T4 DNA 리가아제에 의한 결합은 분석 물질의 3'끝에 대한 방법을 구체화한다. 혈액 내 주요 핵이 3' ~ 5'의 외부 핵이기 때문에 3'-끝에서 레깅에 대한 혼합-레이징 측정의 특수성은 특히 관련이 있다.

이 방법의 한 가지 제한은 예를 들어, 3'-end에 모이를 대상으로 할 때 사용할 수 없는 무료 3'end 히드록실(hydroxyl)이 필요하다는 것이다. 또한, 올리고뉴클레오티드 약물을 사용하는 보다 이국적인 핵산 화학 물질은 사례별로 판단해야 하는 리가제의 활동에 영향을 미칠 수 있다.

듀얼 레그 하이브리드화 검사

듀얼 레그먼트 하이브리드화 검사

DLA(Dual Largion Hybridization Assay)[6]는 교배-교배 분석의 특수성을 모화합물에 대한 특정 방법으로 확장한다. 잡종화-이동성 검사의 강건성, 민감성 및 과두분자 분석 물질의 3'끝에 대한 추가 특수성에도 불구하고, 잡종화-이동성 검사는 분석 물질의 5'끝에 특정되지 않는다.

DLA는 5'와 3'의 끝부분이 모두 온전한 상태에서 전체 길이의 부모 올리고뉴클레오티드 화합물만을 정량화하기 위한 것이다. DLA 탐침은 T4 DNA ligase와 T4 polynucleotide kinase의 공동 작용에 의해 분석물질의 5'와 3'끝에 묶인다. 키나아제는 분석물질의 5'-끝을 인산화하며, 리가제는 포획 프로브를 검출 프로브에 대한 분석 물질에 결합한다. 따라서 DLA의 캡처 및 탐지 프로브는 레인지 프로브라고 불릴 수 있다. 혼합-레이징 검사의 경우, DLA는 돌출 루프에 대한 레깅의 효율성이 낮기 때문에 모화합물에 특수하며, 따라서 DLA는 온전한 5'와 3'끝으로 전체 길이 분석물질을 검출한다. DLA는 또한 생물학적 행렬의 개별 대사물 결정에 사용될 수 있다.

하이브리드 결합-레이징 측정의 제한은 3'end에 무료 히드록실(또는 인산염 그룹)을 추가로 필요로 하는 5'-end와 함께 듀얼 레그레이징 측정에도 적용된다. 또한, T4 DNA 리깅스는 기증자로서 RNA 분자의 레깅(즉, 레깅의 5' 끝에서 RNA)과 양립할 수 없다. 따라서 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-메톡시틸 또는 잠긴 핵산으로 구성된 2세대 항균이 이중 레인지 측정과 호환되지 않을 수 있다.

누클레스 혼성 검사

누클레스 혼성 검사

S1 nuclease cutting assay라고도 하는 [7][8]nuclease hybridization assay는 nuclease protection assay 기반 하이브리드화 ELISA이다. 분석은 S1 누클리스타제를 사용하고 있는데, 단일 가닥 DNA와 RNA를 올리고나 단핵화물로 분해해 온전한 이중 가닥 DNA와 RNA를 남긴다.

누클레스 복합화 분석에서 올리고뉴클레오티드 분석물은 완전히 보완되는 절단 탐침을 통해 96웰 플레이트와 같은 고체 지지대에 포획된다. S1 nuclease에 의한 효소 처리 후 자유 절단 프로브와 대사물에 혼합된 절단 프로브(즉, 분석 물질의 단락)가 분해되어 전신 절단 프로브-아날리테 듀플렉스에서만 신호가 생성될 수 있다.

모폴리노 올리고뉴클레오티드(morpholino oligonucleotide)에 대한 누클리스(nuclease) 측정의 개발에서 예시하듯, 분석은 다양한 화학 물질에 잘 내성이 있다.[9]

이 검사 설정은 견고성이 부족할 수 있으며 FDA의 생물분석적 방법 검증 지침에 따른 검증에 적합하지 않다. 이는 FDA가 제시한 생물분석적 방법에 대한 표준에 따라 검증한 발표된 방법의 부재로 증명된다.

참조

  1. ^ kim, Kalitsis, ji hun, paul; et al. "Nucleic Acids: Hybridisation". wiley. Retrieved 4 February 2017.
  2. ^ Efler, S.M.; Zhang, L.; Noll, B.O.; Uhlmann, E.; Davis, H.L. (2005), "Quantification of oligodeoxynucleotides in human plasma with a novel hybridization assay offers greatly enhanced sensitivity over capillary gel electrophoresis", Oligonucleotides, 15 (2): 119–131, doi:10.1089/oli.2005.15.119, PMID 15989426
  3. ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "A competitive enzyme hybridization assay for plasma determination of phosphodiester and phosphorothioate antisense oligonucleotides", Nucleic Acids Research, 25 (18): 3584–3589, doi:10.1093/nar/25.18.3584, PMC 146941, PMID 9278477[데드링크]
  4. ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "A competitive enzyme hybridization assay for plasma determination of phosphodiester and phosphorothioate antisense oligonucleotides", Nucleic Acids Research, 25 (18): 3584–3589, doi:10.1093/nar/25.18.3584, PMC 146941, PMID 9278477[데드링크]
  5. ^ 미국 특허권 6355438, 브렌다 F. 베이커; 젠그롱 유&자넷 M. 리즈(Leeds)는 2002-03-12년 이시스제약(Isis Pharmical, Inc.)에 배속된 '올리고뉴클레오티드를 계량하는 방법'을 발표했다.
  6. ^ Tremblay, Guy A.; Khalafaghian, Garinée; Legault, Julie; Bartlett, Alan (March 2011), "Dual ligation hybridization assay for the specific determination of oligonucleotide therapeutics", Bioanalysis, 3 (5): 499–508, doi:10.4155/bio.11.18, PMID 21388263
  7. ^ 미국 특허권 8163477, 젠그롱 유; 브렌다 F. 베이커 & 훙장 우(Baker & Hongjang Wu)는 2012-04-24-24를 발행하여, 주식회사 이시스제약에 할당했다.
  8. ^ Xiaohui, Wei; Dai, Guowei; Marcucci, Guido; Liu, Zhongfa; Hoyt, Dale; Blum, William; Chan, Kenneth K. (2006), "A Specific Picomolar Hybridization-Based ELISA Assay for the Determination of Phosphorothioate Oligonucleotides in Plasma and Cellular Matrices", Pharmaceutical Research, 23 (6): 1251–1264, doi:10.1007/s11095-006-0082-3, PMID 16718617
  9. ^ Burki, Umar; Keane, Jonathan; Blain, Alison; O'Donovan, Liz; Gait, Michael J.; Laval, Steven H.; Straub, Volker (2015), "Development and Application of an Ultrasensitive Hybridization-Based ELISA Method for the Determination of Peptide-Conjugated Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides", Nucleic Acid Therapeutics, 25 (5): 275–284, doi:10.1089/nat.2014.0528, PMC 4576940, PMID 26176274