이온 크로마토그래피

Ion chromatography
현대 이온 크로마토그래피 시스템
이온 교환 크로마토그래피
약자IC, IEC
분류크로마토그래피
기타 기술
관련된고성능 액체 크로마토그래피
수성 정상상 크로마토그래피
크기 제외 크로마토그래피
미셀액 크로마토그래피

이온 크로마토그래피(또는 이온 교환 크로마토그래피)는 이온 교환기에 대한 친화력을 바탕으로 이온과 극성 분자를 분리한다.그것은 큰 단백질, 작은 뉴클레오티드, 그리고 아미노산을 포함한 거의 모든 종류의 하전 분자에 작용합니다.단,[1] 이온 크로마토그래피는 단백질의 등전점에서 한 단위 떨어진 조건에서 수행해야 한다.

이온 크로마토그래피에는 음이온 교환과 양이온 교환이 있습니다.캐티온 교환 크로마토그래피는 관심 분자가 양전하를 띠었을 때 사용된다.분자는 크로마토그래피의 pH가 pI(a/k/a pH(I))[2]보다 작기 때문에 양전하를 띤다.이 크로마토그래피 타입에서는 정지상이 음전하되어 양전하 분자가 부하되어 흡인된다.음이온 교환 크로마토그래피는 정지상이 양전하되고 음전하 분자(크로마토그래피의 pH가 [3]pI보다 크다는 의미)가 부하되어 끌어당기는 것을 말한다.단백질 정제, 물 분석,[4][5] 품질 관리에 자주 사용됩니다.단백질, 아미노산 및 펩타이드와 같은 수용성 및 하전 분자는 불용성 정지상에 [6]이온 결합을 형성하여 반대로 대전된 부분에 결합합니다.평형화된 정상상은 분리 및 정량화될 혼합물의 표적 분자가 컬럼을 통과하는 동안 결합할 수 있는 이온화 기능군으로 구성됩니다. 음이온 정상상은 음이온을 분리하는 데 사용되고 음이온 정상상은 양이온을 분리하는 데 사용됩니다.분리하고자 하는 분자가 양이온일 때 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하고 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 [7]음이온을 분리한다.결합된 분자는 이온의 농도가 더 높아지거나 기둥의 pH를 변화시킴으로써 음이온과 양이온을 포함하는 용리액을 사용하여 용출되고 수집될 수 있습니다.

이온 크로마토그래피의 주요 장점 중 하나는 다른 분리 기술에 비해 분리 중에 단 하나의 상호작용만 수반한다는 것이다. 따라서 이온 크로마토그래피는 더 높은 매트릭스 내성을 가질 수 있다.이온 교환의 또 다른 장점은 용출 패턴의 예측 가능성이다(이온화 [8]가능 그룹의 존재에 근거함).예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하면 양이온이 마지막으로 용출됩니다.한편, 음전하 분자가 먼저 용출될 것이다.단, 이온교환 크로마토그래피 실행 시 컬럼 [9]간 불일치를 초래하는 기술에 의한 지속적인 진화 등 단점도 있다.이 정제 기술의 주요 한계는 이온화 [2]기에 한정된다는 것이다.

역사

이온 교환 크로마토그래피

이온 크로마토그래피는 오랜 세월 동안 지식의 축적을 통해 발전해 왔다.1947년부터 Speedding과 Powell은 희토류를 분리하기 위해 치환 이온 교환 크로마토그래피를 사용했다.또한 암모니아 내 14N과 15N 동위원소의 이온 교환 분리를 보여주었다.1950년대 초에 Kraus와 Nelson은 음이온 크로마토그래피로 염화물, 불소화물, 질산염 또는 황산염 복합체의 분리에 의존하는 금속 이온에 대한 많은 분석 방법을 사용하는 것을 시연했습니다.자동 인라인 검출은 1960년부터 1980년까지 점진적으로 도입되었으며 금속 이온 분리를 위한 새로운 크로마토그래피 방법도 도입되었다.다우 케미컬사의 스몰, 스티븐스, 바우만이 개발한 획기적인 방법은 현대 이온 크로마토그래피의 탄생을 알렸다.음이온과 양이온은 이제 억제된 전도율 검출 시스템에 의해 효율적으로 분리될 수 있습니다.1979년 Gjerde 등에 의해 비억제 전도율 검출 음이온 크로마토그래피 방법이 도입되었다.1980년에 이어 카티온 [10]크로마토그래피에도 비슷한 방법이 있었다.

그 결과, IC 시장 내에서 억제 및 비억제 전도율 검출에 대한 지지자들과 함께 치열한 경쟁이 치열해졌습니다.이 경쟁은 새로운 형태의 빠른 성장과 [11]IC의 빠른 진화로 이어졌다.향후 IC의 개발에서 극복해야 할 과제는 매우 효율적인 단일 이온 교환 컬럼의 준비이며,[12] 이 과제를 극복하는 것은 IC의 발전에 매우 중요할 것이다.

이온 교환 크로마토그래피의 붐은 주로 제2차 세계대전 기간인 1935-150년 사이에 시작되었으며 애플리케이션과 IC가 크게 확장된 것은 "맨하탄 프로젝트"를 통해서였다.이온 크로마토그래피는 원래 두 명의 영국 연구자들, 즉 농업 연구자 톰슨과 화학자 J T Way에 의해 도입되었다.톰슨과 웨이의 연구는 수용성 비료 소금, 황산암모늄, 염화칼륨의 작용을 수반했다.이 소금들은 비 때문에 땅에서 쉽게 추출되지 않았다.그들은 점토를 소금으로 처리하는 이온 방법을 실행했고,[13][unreliable source?] 그 결과 칼슘의 방출과 더불어 암모니아를 추출했다.더 많은 이해를 위해 IC에 대한 이론적 모델이 개발된 것은 50년대와 60년대였으며, 70년대에 이르러서야 연속 검출기가 사용되면서 저압에서 고성능 크로마토그래피로 발전하는 길을 열었다.1975년이 되어서야 "이온 크로마토그래피"라는 명칭이 기술들과 관련하여 확립되었고, 그 후 마케팅 목적으로 사용되었다.오늘날 IC는 식수와 같은 수계 조사에 중요하다.음이온 원소나 복합체를 분석하여 환경 관련 문제를 해결하는 데 도움이 되는 인기 있는 방법입니다.마찬가지로 반도체 산업에서도 활용도가 높다.

풍부한 분리 컬럼, 용출 시스템 및 검출기 때문에 크로마토그래피는 이온 [14]분석의 주요 방법으로 발전했다.

이 기술이 처음 개발되었을 때 주로 수처리에 사용되었습니다.1935년 이후 이온 교환 크로마토그래피는 증류, 흡착, 여과 [15]등 화학의 대부분 분야에 그 원리가 적용되면서 가장 많이 활용되는 기술 중 하나로 빠르게 나타났다.

원칙

음이온 분리를 나타내는 이온 크로마토그램

이온 교환 크로마토그래피는 각각의 하전된 그룹에 따라 분자를 분리한다.이온 교환 크로마토그래피는 쿨롱(이온) 상호작용에 기초한 분석물 분자를 컬럼에 유지합니다.이온 교환 크로마토그래피 매트릭스는 양전하 [16]이온과 음전하 이온으로 구성됩니다.기본적으로, 분자는 정지상 매트릭스 상에서 반대 전하와 정전 상호작용을 합니다.정지상은 하전 이온화 관능기 또는 [17]배위자를 포함하는 고정 매트릭스로 구성됩니다.정지상 표면에는 반대 전하의 분석물 이온과 상호작용하는 이온성 관능기(R-X)가 표시됩니다.전기중성(electronomutrality)을 달성하기 위해 이러한 불활성 전하가 용액에서 교환 가능한 반작용과 결합됩니다.정제해야 할 이온화 분자는 이러한 교환 가능한 반작용과 정지상에서의 고정화 전하와의 결합을 위해 경쟁한다.이러한 이온화 가능한 분자는 전하를 기반으로 유지되거나 용출됩니다.처음에는 정지상에 약하게 결합하거나 결합하지 않는 분자가 먼저 씻겨 내려갑니다.정지상에 결합하는 분자의 용출을 위해서는 변화된 조건이 필요하다.결합을 위해 분자와 경쟁하는 교환성 대항체의 농도를 높이거나 pH를 변경할 수 있다.pH의 변화는 특정 분자의 전하에 영향을 미쳐 결합을 변화시킨다.그리고 나서 분자는 조절로 인한 전하 변화에 따라 용출되기 시작합니다.이러한 조정은 관심 단백질을 방출하기 위해 사용될 수 있다.또, 이온화 분자를 분리하기 위해서, 이온화 농도를 서서히 변화시킬 수 있다.이런 종류의 용출은 경사 용출이라고 불린다.한편,[1] 1공정에서 이온 농도를 변화시키는 스텝 용출법을 사용할 수 있다.이러한 유형의 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피로 더욱 세분화된다.양전하 분자는 양이온 교환 수지에 결합하고 음전하 분자는 음이온 교환 [18]수지에 결합합니다.양이온종 M+와 음이온종 B-로 이루어진 이온성 화합물은 정상상으로 유지할 수 있다.

양이온 교환 크로마토그래피는 정전기가 음전하를 띠기 때문에 양이온을 유지합니다.

음이온 교환 크로마토그래피는 양전하를 띤 관능기를 사용하여 음이온을 유지합니다.

이동상에서의 C+ 또는 A- 중 하나의 이온 강도는 평형 위치를 이동하도록 조정될 수 있으며, 따라서 유지 시간이 조정될 수 있음에 유의하십시오.

이온 크로마토그램은 음이온 교환 컬럼으로 얻은 전형적인 크로마토그램입니다.

절차.

이온 교환 크로마토그래피를 시작하기 전에 평형을 이루어야 합니다.정상 위상은 작업 중인 실험에 따라 달라지는 특정 요구 사항과 평형 상태여야 합니다.일단 평형을 이루면, 정지상의 대전 이온은 반대되는 대전 교환 이온에 부착됩니다.Cl- 또는 Na+와 같은 교환 가능한 이온.다음으로 원하는 단백질이 결합할 수 있는 완충제를 선택해야 한다.평형 후에는 Column을 세척해야 합니다.세척 단계는 대상 단백질이 경계를 유지하는 동안 매트릭스에 결합하지 않는 모든 불순물을 용출하는 데 도움이 됩니다.이 샘플 버퍼는 원하는 단백질의 결합을 돕기 위해 균등화에 사용되는 버퍼와 동일한 pH를 가져야 합니다.충전되지 않은 단백질은 칼럼을 흐르는 완충제와 비슷한 속도로 칼럼 밖으로 용출될 것이다.샘플이 컬럼에 로드되고 컬럼이 버퍼로 세척되어 모든 비희망 단백질을 용출하면 용출이 실행되어 매트릭스에 결합되어 있는 원하는 단백질을 용출한다.염분 농도가 선형적으로 증가하는 구배를 이용하여 결합단백질을 용출한다.완충제의 이온 강도가 증가함에 따라, 소금 이온은 매체 표면의 하전된 그룹에 결합하기 위해 원하는 단백질과 경쟁할 것입니다.이것은 원하는 단백질이 컬럼 밖으로 용출되도록 할 것이다.순전하가 낮은 단백질은 염분 농도가 높아지면서 이온 강도가 높아지면서 먼저 용출된다.높은 순전하를 가진 단백질은 그들이 컬럼 밖으로 [16]용출되기 위해 더 높은 이온 강도를 필요로 할 것이다.원하는 정지상 층으로 코팅된 유리 또는 플라스틱 판과 같은 얇은 매체 층 또는 크로마토그래피 컬럼에서 대량으로 이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있습니다.얇은 층 크로마토그래피 또는 컬럼 크로마토그래피는 둘 다 동일한 지배 원리 내에서 작용한다는 점에서 유사성을 공유합니다; 이동상이 정지상을 따라 이동함에 따라 분자의 지속적이고 빈번한 교환이 있습니다.이동 상과 정지 상 사이에 강한 상호작용이 일어나도록 교환 컬럼에 대해 미리 정해진 조건이 선택되었기 때문에 샘플을 미량으로 추가할 필요는 없습니다.또한 용출 과정의 메커니즘은 각각의 화학적 특성에 따라 다른 분자의 구획화를 야기할 것이다.이러한 현상은 기둥의 꼭대기 또는 그 부근에서 염분 농도가 증가하여 분자가 그 위치에서 치환되는 반면, 낮은 위치에 결합되어 있는 분자는 더 높은 염분 농도가 그 영역에 도달하면 나중에 방출됩니다.이러한 원리는 이온 교환 크로마토그래피가 더 큰 시작 [2]부피와 상관없이 소량의 표적 분자를 빠르게 생산할 수 있기 때문에 복잡한 정제 절차에서 초기 크로마토그래피 단계에 매우 적합한 이유입니다.

챔버(왼쪽)에는 염분 농도가 높습니다.교반 챔버(오른쪽)의 염분 농도가 낮습니다.서서히 저으면 염분이 고농도에서 저농도로 이동하면서 염분 구배가 형성됩니다.

크로마토그래피 컬럼에 대해 구배 증가의 반작용을 적용하기 위해 비교적 간단한 장치가 종종 사용된다.복잡한 [19]형성을 통해 펩타이드와 아미노산을 효과적으로 분리하기 위해 구리(II)와 같은 대항제가 가장 자주 선택된다.

간단한 장치를 사용하여 염분 구배를 만들 수 있습니다.용출 버퍼는 챔버에서 믹싱 챔버로 일정하게 흡입되어 버퍼 농도를 변화시킨다.일반적으로 챔버 내에 배치되는 버퍼는 초기 농도가 높은 반면 교반 챔버 내에 배치되는 버퍼는 일반적으로 농도가 낮은 편이다.좌측 챔버로부터의 고농도 버퍼가 혼합되어 컬럼에 유입됨에 따라 교반 컬럼의 버퍼 농도는 점차 높아진다.교반된 챔버의 모양과 한계 버퍼의 모양을 변경하면 오목, 선형 또는 볼록한 대향 구배를 생성할 수 있습니다.

정지상에는 다수의 다른 매체가 사용됩니다.사용되는 가장 일반적인 고정화 대전기는 트리메틸아미노에틸(TAM), 트리에틸아미노에틸(TEAE), 디에틸-2-히드록시프로필아미노에틸(QAE), 아미노에틸(AE), 디에틸아미노에틸(DEAE), 술포(SMOPYL), 술프로필(SPYC)이다.

컬럼의 성공적인 패킹은 이온 크로마토그래피의 중요한 측면입니다.최종 기둥의 안정성 및 효율성은 포장 방법, 사용된 용제 및 기둥의 기계적 특성에 영향을 미치는 요인에 따라 달라집니다.초기 비효율적인 건식 패킹 방법과는 달리 적절한 용매에 부유된 입자가 압력에 의해 기둥에 전달되는 습식 슬러리 패킹은 상당한 개선을 보인다.습식 슬러리 패킹에는 균형밀도법(용제의 밀도는 다공질 실리카 입자의 밀도 정도), 고점도법(고점도 용제 사용) 및 저점도 슬러리법(저점도 [20]용제 사용)의 3가지 다른 방법을 사용할 수 있다.

폴리스티렌은 이온 교환 매체로 사용된다.그것은 디비닐벤젠과 과산화벤조일을 사용하여 스티렌의 중합으로 만들어진다.이러한 교환기는 되돌릴 수 없는 단백질과 소수성 상호작용을 형성한다.이러한 특성 때문에 폴리스티렌 이온 교환기는 단백질 분리에 적합하지 않습니다.반면 아미노산 분리 시 작은 분자를 분리하거나 물에서 염분을 제거하는 데 사용된다.모공이 큰 폴리스티렌 이온 교환기는 단백질 분리에 사용할 수 있지만 친수성 [21]물질로 코팅해야 한다.

셀룰로오스계 배지는 큰 모공을 포함하고 있어 큰 분자의 분리에 사용할 수 있다.이 배지의 단백질 결합은 높고 소수성이 낮다.DEAE는 셀룰로오스 또는 세파덱스에 [22]결합되어 있는 디에틸아미노에틸의 양성 측기로부터 생성되는 음이온 교환 매트릭스입니다.

아가로스겔계 배지는 모공도 크지만 덱스트랜에 비해 치환성이 낮다.액체에서 배지가 팽창하는 능력은 이러한 물질의 가교, pH 및 사용된 [21]버퍼의 이온 농도에 기초한다.

고온과 압력의 통합은 시간 단축과 함께 이온 크로마토그래피의 효율성을 크게 높일 수 있습니다.온도는 유지 특성에 영향을 미치기 때문에 선택성에 영향을 미칩니다.유지율(k = (tRg - tMg)/(tMg - text))은 이온이 작을 경우 온도에 따라 증가하며 이온이 [23][24]클 경우 반대의 경향을 보인다.

서로 다른 매체에서 이온 선택성에도 불구하고 40~[25]175°C 범위에서 이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위한 추가 연구가 이루어지고 있습니다.

컬럼 입자가 용매 내에서 어떻게 작용하는지에 대한 관찰에 기초하여 적절한 용매를 선택할 수 있다.광학 현미경을 사용하면 바람직한 분산 상태의 슬러리와 응집 [20]입자를 쉽게 구별할 수 있다.

약하고 강한 이온 교환기

"강력한" 이온 교환기는 일단 칼럼이 평형화되면 매트릭스 상의 전하를 잃지 않기 때문에 광범위한 pH 버퍼를 사용할 수 있습니다."약한" 이온 교환기는 전하를 유지하는 pH 값의 범위가 있습니다.약한 이온 교환 컬럼에 사용되는 버퍼의 pH가 매트릭스의 용량 범위를 벗어나면 컬럼의 전하 분포가 상실되어 관심 분자가 [26]상실될 수 있다.약한 이온 교환기의 pH 범위는 작지만 특이성이 크기 때문에 강한 이온 교환기에 사용되는 경우가 많습니다.일부 실험에서, 약한 이온 교환기의 유지 시간은 높은 [27]특이도에서 원하는 데이터를 얻을 수 있을 정도로 충분히 길다.

이온 교환 컬럼의 수지(흔히 '비드'라고 불린다)는 약한/강한 산과 약한/강한 염기와 같은 관능기를 포함할 수 있다.양이온과 [28]음이온을 교환할 수 있는 양성 관능기를 가진 특수 열도 있습니다.강한 이온 교환 수지의 관능기로는 음이온 교환기인 4급 암모늄 양이온(Q)과 양이온 [29]교환기인 술폰산(S, -SOH2)이 있다.이러한 유형의 교환기는 0~14의 pH 범위에서 전하 밀도를 유지할 수 있습니다.약이온교환수지의 관능기로는 음이온교환기인 디에틸아미노에틸(DEAE, -CHN24(CHH25))2과 양이온교환기인 카르복시메틸(CM, -CH-COOH2)[30]이 있다.이 두 가지 유형의 교환기는 5~9개의 [citation needed]pH 범위에서 기둥의 전하 밀도를 유지할 수 있습니다.

이온 크로마토그래피에서 용질 이온과 그 전하를 바탕으로 한 정지상의 상호작용에 의해 어떤 이온이 결합하고 어느 정도 결합할지가 결정된다.정지상에 음이온을 끌어들이는 양의 그룹이 있으면 음이온 교환기라고 하며, 정지상에 음의 그룹이 있으면 양이온을 끌어당겨 양이온 [31]교환기입니다.이온과 정지상 사이의 인력은 또한 이온 교환기로 사용되는 수지, 유기 입자에 따라 달라집니다.

각 수지는 상대적인 선택성을 특징으로 하며, 상대적인 선택성은 존재하는 용질 이온에 따라 달라집니다.평형 상수에 해당하는 선택성 계수는 수지와 각 이온 사이의 농도 비율을 통해 결정되지만, 일반적인 경향은 이온 교환기가 높은 전하, 작은 수화 반지름, 높은 분극성 또는 i의 전자 구름에 대한 능력을 가진 이온에 대한 결합을 선호한다는 것입니다.다른 [32]혐의에 의해 방해될 수 있습니다.이러한 선택성에도 불구하고, 컬럼에 낮은 선택성을 가진 이온의 과도한 양은 선택성 계수를 통해 이온 교환 크로마토그래피 중에 발생하는 결합 반응의 변동을 허용하기 때문에 적은 이온이 정지상에 더 많이 결합하게 된다.

다음 표는 일반적으로 사용되는 이온 교환기입니다.

시니어 No. 이름. 유형 기능군
1 DEAE 셀룰로오스(음이온 교환기) 약기성 디에틸아미노에틸
2 QAE Sephadex(음이온 교환기) 매우 기본적 4차 아미노에틸
3 Q 세팔로스(음이온 교환기) 매우 기본적 Q (4차 암모늄)
4 CM-셀룰로오스(카티온 교환기) 약산성 CM(카르복시메틸)
5 SP 세팔로스(카티온 교환기) 강산성 SP(술포프로필)
6 소스 S(카티온 교환기) 강산성 S(황산메틸)

전형적인 기술

샘플은 수동으로 또는 자동 샘플러를 사용하여 기존 볼륨의 샘플루프에 도입됩니다.이동상으로 알려진 완충 수용액은 루프에서 어떤 형태의 고정상 재료를 포함하는 컬럼으로 샘플을 운반한다.이것은 일반적으로 공유 결합 하전된 관능기를 가진 아가로스 또는 셀룰로오스 비즈로 구성된 수지 또는 겔 매트릭스입니다.칼럼의 원하는 전하를 얻기 위해서는 정지상의 평형이 필요하다.컬럼이 적절하게 평형되지 않으면 원하는 분자가 컬럼에 강하게 결합되지 않을 수 있습니다.대상 분석물(음이온 또는 양이온)은 정지상에 유지되지만, 분석물 이온을 정지상에서 치환하는 유사한 하전종의 농도를 증가시킴으로써 용출할 수 있다.예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피에서는 양전하 분석물을 양전하 나트륨 이온을 첨가함으로써 치환할 수 있다.그런 다음 관심 있는 분석물은 일반적으로 전도성 또는 자외선/가시광 흡수도에 의해 검출되어야 한다.

IC 시스템을 제어하려면 일반적으로 크로마토그래피 데이터 시스템(CDS)이 필요합니다.IC 시스템 외에 이러한 CDS 중 일부는 가스 크로마토그래피(GC) 및 HPLC도 제어할 수 있습니다.

막교환크로마토그래피

이온[34][35] 교환 크로마토그래피의 일종인 막 교환은 비즈로 채워진 기둥을 사용하는 한계를 극복하기 위해 설계된 비교적 새로운 정제 방법입니다.멤브레인[36][37] 크로마토그래피 장치는 유지 보수와 재검증 시간이 필요한 다른 크로마토그래피 장치와 달리 대량 생산 비용이 저렴하고 일회용입니다.일반적으로 물질을 분리할 때 사용되는 세 가지 유형의 막 흡수제가 있습니다.플랫 시트, 중공사, 레이디얼 플로우의 3종류가 있습니다.가장 일반적인 흡수체이며 멤브레인 크로마토그래피에 가장 적합한 것은 흡수 부피가 더 크기 때문에 여러 장의 평판 시트입니다.이것은 질량 전달[38] 제한과 압력 [39]강하를 극복하는데 사용될 수 있으며, 바이러스, 플라스미드 DNA, 그리고 다른 큰 고분자를 분리 및 정제하는 데 특히 유리합니다.컬럼은 표적 단백질을 결합할 수 있는 흡착성 부분을 포함하는 내부 모공을 가진 미세 구멍 막으로 채워져 있습니다.흡착막은 다양한 기하학적, 화학적으로 이용 가능하며 [40]비즈의 10배에 달하는 효율로 정제, 분류, 농축, 정화에 사용할 수 있다.막은 막 자체의 분리를 통해 준비될 수 있으며, 여기서 막은 정사각형으로 절단되고 고정됩니다.보다 최근의 방법은 지지막에 부착되어 신호 [41]분자의 식별과 명확화에 사용되는 살아있는 세포를 사용하는 것이다.

단백질 분리

단백질 정화에 사용되는 준비 스케일 이온 교환 컬럼.

이온 교환 크로마토그래피는 단백질을 분리하는데 사용될 수 있습니다. 왜냐하면 단백질은 하전된 작용기를 포함하고 있기 때문입니다.관심 이온(이 경우 하전 단백질)은 하전된 고체 지지대 위에 있는 다른 이온(일반적으로+ H)과 교환됩니다.용질들은 가장 일반적으로 물인 액체상에 있다.예를 들어 물 속의 단백질은 기둥을 통과하는 액체상입니다.기둥은 특정 전하의 다공질 합성 입자로 채워져 있기 때문에 일반적으로 고체상으로 알려져 있습니다.이러한 다공질 입자는 비즈라고도 하며, 전하를 띠기 위해 아미노기를 포함하거나 금속 이온을 가질 수 있습니다.컬럼은 다공질 폴리머를 사용하여 제조할 수 있으며, 10만 이상의 고분자의 경우 다공질 입자의 최적 크기는 약 1μm이다2.이는 모공 내에서 용질이 천천히 확산되는 것이 분리 [42]품질을 제한하지 않기 때문입니다.음전하 단백질을 끌어당기는 양전하 그룹을 포함하는 비즈는 일반적으로 음이온 교환 수지라고 불립니다.pH 7(물의 pH)에서 음전하를 띠는 아미노산은 글루탐산염과 아스파르트산이다.음전하를 띠는 구슬은 양이온 교환 수지라고 불리는데, 양전하를 띠는 단백질이 흡인되기 때문입니다.pH7에서 양전하를 띠는 아미노산은 리신, 히스티딘, 아르기닌이다.[43]

등전점은 화합물(이 경우 단백질)이 순전하를 가지지 않는 pH입니다.단백질의 등전점 또는 PI는 측쇄의 pKa를 사용하여 결정될 수 있으며, 아미노(양사슬)가 카르복실(음사슬) 사슬을 상쇄할 수 있다면 단백질은 PI에 있을 것이다.pH 7에서 전하를 띠지 않는 단백질을 위해 물 대신 완충제를 사용하는 것은 단백질과 구슬 사이의 이온 상호작용을 [44]변화시키기 위해 pH의 조작을 가능하게 하기 때문에 좋은 생각이다.약산성 또는 염기성 측쇄는 각각 pH가 충분히 높거나 낮으면 전하를 가질 수 있다.단백질의 자연 등전점에 근거해 분리를 실시할 수 있다.또는 단백질에 펩타이드 태그를 유전적으로 첨가하여 단백질에 대부분의 천연 단백질로부터 등전점(예를 들어 양이온 교환 수지에 결합하기 위한 6개의 아르기닌 또는 DEAE-세파로스 등의 음이온 교환 수지에 결합하기 위한 6개의 글루타메이트)을 부여할 수 있다.

이동상의 이온 강도를 높임으로써 용출하는 것은 보다 미묘하다.이동상의 이온이 정지상의 고정화 이온과 상호작용하여 단백질로부터 정지상을 "차폐"하고 단백질이 용출되도록 하기 때문에 작용한다.

이온 교환 컬럼에서의 용출은 단일 전하 크로마토포커스 변화에 민감할 수 있습니다.이온 교환 크로마토그래피는 또한 하전된 펩타이드 [45][46]태그의 수와 위치 양쪽에 따라 특정 복합체의 정화를 가능하게 하여 특정 다량체 단백질 집합체의 분리에도 유용하다.

깁스-도난 효과

이온 교환 크로마토그래피에서는 적용된 버퍼와 이온 교환기의 pH가 1 pH 단위까지 다를 때 깁스-도난 효과가 관찰된다.예를 들어 음이온교환칼럼에서는 이온교환기가 양성자를 폐지하기 때문에 컬럼 부근의 버퍼의 pH가 나머지 [47]용제보다 높아진다.그 결과, 실험자는 관심 단백질이 안정적이고 "실제" pH에서 적절히 충전되도록 주의해야 한다.

이 효과는 비슷하게 하전된 두 개의 입자(하나는 수지에서, 다른 하나는 용액에서)가 양쪽 사이에 적절히 분포하지 못하기 때문에 발생합니다. 즉, 한쪽 이온이 다른 [48][49]쪽 이온에 선택적으로 흡수됩니다.예를 들어 황화 폴리스티렌 수지, 양이온 교환 수지에서 염산 완충제의 염소 이온이 수지 내에 평형화되어야 한다.단, 수지 중 황산 농도가 높기 때문에 HCl의 수소가 컬럼에 들어가는 경향이 없다.이는 전기중성 필요성과 결합되어 수지로 [49]유입되는 수소와 염소의 양을 최소화합니다.

사용하다

임상적 효용

이온 크로마토그래피의 사용은 어젠테이션 [citation needed]크로마토그래피에서 볼 수 있다.보통, 은과 아세틸렌과 에틸렌 결합을 포함하는 화합물은 매우 약한 상호작용을 가지고 있다.이 현상은 올레핀 화합물에 대해 광범위하게 시험되었다.올레핀이 은이온과 함께 만드는 이온 복합체는 약하고 파이, 시그마, d 오비탈의 중첩에 기초하여 만들어지며 따라서 이용 가능한 전자는 이중 결합에 실질적인 변화를 일으키지 않는다.이 동작은 은 이온을 사용하는 이중 결합 수가 다른 분율까지 주로 지방산인 지질들을 분리하기 위해 조작되었다.이온 수지에 은 이온을 함침시킨 다음, 다양한 산(실산)에 노출되어 다른 특성의 지방산을 용출했습니다.

알칼리 금속 [50]이온에 대해 1μM 이하의 검출 한계를 얻을 수 있다.HbA1c, 포르피린 측정 및 정수 작업에 사용할 수 있다.이온교환수지(IER)는 특히 높은 용량과 분리 과정이 복잡하지 않은 시스템 때문에 의약품에 널리 사용되어 왔다.합성 용도 중 하나는 신장 투석을 위해 이온 교환 수지를 사용하는 것입니다.셀룰로오스 막질 인공신장을 [51]이용하여 혈액의 성분을 분리하는 방법이다.

이온 크로마토그래피의 또 다른 임상적 응용은 크레아틴 키나제(CK) 동질효소를 부검 물질에서 소싱된 인간 혈청 및 조직으로부터 분리하는 데 사용되는 음이온 교환 크로마토그래피 기술이다(대부분 CK 리치 조직이 심장 근육 및 [citation needed]뇌와 같이 사용됨).이러한 동질효소는 서로 다른 아미노산 배열이 주어졌을 때 모두 동일한 기능을 수행하는 MM, MB 및 BB를 포함한다.이러한 아이소엔자임들의 기능은 ATP를 사용하여 크레아틴을 ADP를 배출하는 포스포크레아틴으로 변환하는 것이다.미니 컬럼은 DEAE-Sephadex A-50으로 채워졌고 다양한 농도로 염화나트륨으로 용출되었다(각 농도는 용출 조작에 유리하게 선택되었다).분리를 위해 인간 조직 추출물을 기둥에 삽입했다.모든 분율을 분석하여 총 CK 활성을 확인하였으며, CK 동질효소의 각 공급원은 특징적인 동질효소를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.먼저, CK-MM이 용출된 후, CK-MB가 그 뒤를 이어 CK-BB가 나왔습니다.따라서 각 샘플에서 발견된 등유효소는 조직 특이적이기 때문에 선원을 식별하는 데 사용될 수 있었다.

결과로부터 얻은 정보를 이용하여, 환자의 진단과 가장 풍부한 활동에서 발견되는 CK 동질효소의 종류에 대한 상관관계를 만들 수 있었다.연구 결과 71명 중 35명 정도가 심장마비(심근경색)를 앓고 있었으며 CK-MM과 CK-MB 동질효소가 풍부하게 함유돼 있었다.연구결과는 신부전, 뇌혈관질환, 폐질환을 포함한 많은 다른 진단들이 CK-MM 동질효소를 가지고 있을 뿐 다른 동질효소는 없는 것으로 밝혀졌다.이 연구의 결과는 다양한 질병과 다양한 기술을 사용하여 이전 테스트 결과를 확인하는 CK 동질효소의 상관관계를 나타낸다.이 연구와 이온 크로마토그래피 적용 이후 심장마비 환자에서 발견된 CK-MB에 대한 연구는 확대되었다.

산업용 응용 프로그램

1975년부터 이온 크로마토그래피는 많은 산업 분야에서 널리 사용되어 왔다.주요 장점은 신뢰성, 매우 우수한 정확도와 정밀도, 높은 선택성, 고속, 높은 분리 효율성 및 낮은 소모품 비용입니다.이온 크로마토그래피와 관련된 가장 중요한 발전은 새로운 샘플 준비 방법; 분석물 분리 속도와 선택성 향상; 검출 한계 및 정량 한계 감소; 적용 범위 확장; 새로운 표준 방법의 개발; 분석의 범위 소형화 및 확장이다.새로운 물질 그룹의 s.전해질 및 전기 도금 [52]용조의 독점 첨가물의 정량적 시험을 허용합니다.정성적 선체 세포 테스트 또는 덜 정확한 자외선 테스트의 발전입니다.이온, 촉매, 브라이더 및 가속기를 [52]측정할 수 있습니다.이온 교환 크로마토그래피는 점차 음이온과 양이온 종 모두를 검출하는 널리 알려진 보편적인 기술이 되었다.이러한 목적을 위한 애플리케이션은 다양한 관심 분야, 특히 제약 산업에 대해 개발 중이거나 개발 중에 있습니다.최근 몇 년 동안 의약품에서의 이온 교환 크로마토그래피 사용이 증가하여 2006년에는 공식적으로 미국 약국 조제법(USP-NF)에 이온 교환 크로마토그래피에 관한 장이 추가되었다.또한 2009년 USP-NF 발표에서 미국 약국은 전도율 검출과 펄스 암페로미터 검출의 두 가지 기법을 사용하여 이온 크로마토그래피의 여러 분석을 이용할 수 있도록 했다.이러한 애플리케이션의 대부분은 주로 옥살산염, 요오드화물, 황산염, 술파민산염, 인산염 및 칼륨 및 나트륨을 포함한 다양한 전해질의 한계를 검출하는 것을 포함하여 의약품의 잔류 한계를 측정하고 분석하는 데 사용됩니다.USP-NF 2009년판에서는 전도도 검출 또는 펄스 암페로미터 [53]검출 중 하나를 사용하여 활성 화합물 또는 활성 화합물 성분을 분석하기 위한 28가지 검출 방법이 공식적으로 발표되었습니다.

의약품 개발

예상 기침 제제의 나트륨, 암모늄 및 칼륨과 같은 양이온을 검출하고 측정하는 데 사용되는 이온 크로마토그래피 시스템입니다.

의약품 분석에 IC를 적용하는 것에 대한 관심이 높아지고 있다.IC는 제품 개발 및 품질 관리 테스트의 다양한 측면에 사용됩니다.예를 들어 IC는 의약품 활성약 분자의 안정성과 용해성 특성을 개선하고 유기용매에 대한 내성이 높은 시스템을 검출하는 데 사용된다.IC는 용해 테스트의 일부로서 분석 물질의 측정에 사용되어 왔다.예를 들어, 칼슘 용해 테스트에서 배지에 존재하는 다른 이온들은 서로 잘 분해될 수 있고 칼슘 이온으로부터도 잘 분해될 수 있는 것으로 나타났습니다.따라서 IC는 시간과 [54]함께 용해되는 약물의 양을 결정하기 위해 알약과 캡슐 형태의 약물에 사용되어 왔다.IC는 또한 약제제에서 사용되는 이형성분 또는 비활성성분의 검출 및 정량화에 널리 사용된다.이러한 극성기가 이온 컬럼에서 분해되기 때문에 IC를 통해 이러한 제제의 설탕 및 설탕 알코올을 검출할 수 있습니다.IC 방법론은 약물 및 제품의 불순물 분석에서도 확립되었다.불순물 또는 약물 화학 주체의 일부가 아닌 성분들을 평가하여 환자에게 하루에 [55]투여해야 하는 약물의 최대 및 최소 양에 대한 통찰력을 제공한다.

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참고 문헌

외부 링크

라이브러리 리소스 정보
이온 교환 크로마토그래피