2차원 크로마토그래피

Two-dimensional chromatography
2016년 폴란드 GUTGdasksk 화학 교수진의 2차원 크로마토그래프 GCxGC-TOFMS

2차원 크로마토그래피는 주입된 샘플이 서로 다른 두 개의 분리 단계를 통과해 분리되는 크로마토그래피 기법의 일종이다. 서로 다른 두 개의 크로마토그래픽 컬럼이 순차적으로 연결되며, 첫 번째 시스템의 유출액이 두 번째 컬럼으로 전달된다.[1] 일반적으로 두 번째 열은 분리 메커니즘이 다르기 때문에 첫 번째 열에서 잘 해결되지 않는 밴드는 두 번째 열에서 완전히 분리될 수 있다. (예를 들어, C18 역상 크로마토그래피 열은 페닐 열 뒤에 나올 수 있다.) 또는 두 기둥은 서로 다른 온도에서 달릴 수 있다. 2단계 분리 중에는 여전히 단일 검출기(Detector)만 존재하므로 분리가 발생하는 속도가 1단계보다 빨라야 한다. 평면 표면은 두 개의 서로 다른 용매를 사용하여 두 방향으로 순차적으로 개발할 수 있다.

역사

현대의 2차원 크로마토그래피 기법은 액상 이동 단계와 고체 정지 단계가 포함된 종이 크로마토그래피와 박층 크로마토그래피의 초기 개발 결과를 바탕으로 한다. 이 기법들은 후에 현대 가스 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 분석을 생성할 것이다. 1차원 GC와 LC의 다른 조합은 2차원 크로마토그래피라고 알려진 해석 크로마토그래피 기법을 생산했다.

2D 색채사진술의 초기 형태는 얇은 셀룰로오스 시트를 먼저 한 방향으로 용매로 사용한 후 종이가 건조된 후 다른 용매를 첫 번째 방향과 직각으로 실행하는 다단계 TLC 분리 형태로 나왔다. 이 방법론은 A. J. P. 마틴과 동료들이 아미노산 분리를 위한 효율적인 방법을 상세히 기술한 1944년 간행물과 함께 문헌에 처음 등장했다. "...하지만, 이차원 크로마토그램은 수많은 실험의 결과로서만 달리 얻을 수 있는 정보를 한눈에 보여준다는 점에서 특히 편리하다."(Bi)오켐 J, 1944, 38, 224).

예

가스 크로마토그래피나 액체 크로마토그래피에서는 2차원 분리를 실시할 수 있다. 첫 번째 열에서 두 번째 열로 "복제"하는 다양한 연결 전략이 개발되었다. 2차원 분리를 위한 중요한 하드웨어로는 1차원 용출물을 2차원 기둥에 선택적으로 전달하는 Deans 스위치와 Modulator가 있다.

2차원 기술의 주요 이점은 그들이, 어느 칼럼에 극히 효율적인 분리는 요구하지 않고입니다, 그리고 두번째 칼럼 5(k2)의5-second separation,에 정점 용량을 제공한다 최고의 효과에 큰 증가(예를 들어, 첫번째 기둥이 최고의 효과(k1을 제공한다)of 10010분 정도 거리를을 제공합니다.t총 분리 시간이 여전히 ~ 10분인 상태에서 총 피크 용량이 k1 × k2=500에 도달할 수 있다. 가솔린 및 기타 석유 혼합물 분석에 2D 분리가 적용되었으며, 최근에는 단백질 혼합물에도 적용되었다.[3][4]

탠덤 질량 분광법

삼중 쿼드폴(QQQ) 질량 분석기의 다이어그램.
주요 기사: 탠덤 질량 분광법

탠덤 질량 분광기(Tandem MS 또는 MS/MS)는 분석 물질의 더 복잡한 혼합물을 분리하기 위해 두 개의 질량 분석기를 순차적으로 사용한다. 탠덤MS의 장점은 다른 2차원 방식보다 훨씬 빠를 수 있다는 점인데, 시간은 밀리초에서 초까지 다양하다.[5] MS에서는 용제의 희석이 없기 때문에 간섭 가능성이 적기 때문에 탠덤 MS는 다른 2차원 방법에 비해 민감하고 신호 대 잡음 비율이 높을 수 있다. 탠덤 MS와 관련된 주요 단점은 필요한 계측기의 높은 비용이다. 가격은 50만 달러에서 100만 달러 이상까지 다양하다.[6] 많은 형태의 탠덤 MS는 대량 선택 단계와 단편화 단계를 포함한다. 첫 번째 질량 분석기는 특정 질량 대 충전 비율의 분자만 통과하도록 프로그래밍할 수 있다. 그리고 나서 두 번째 질량 분석기는 분자의 정체를 알아내기 위해 분자를 조각낼 수 있다. 이것은 특히 같은 질량의 분자(즉, 같은 질량의 단백질이나 분자 이성질체의 단백질)를 분리하는 데 유용할 수 있다. 다양한 유형의 질량 분석기를 결합하여 다양한 효과를 얻을 수 있다. 한 예로 TOF-Quadruppole 시스템을 들 수 있다. 이온은 순차적으로 분해되거나 TOF를 떠나면서 m/z 증가의 순서로 4중극으로 분석될 수 있다. 또 다른 일반적인 탠덤 질량 분석기는 쿼드폴-쿼드루폴-쿼드루폴(Q-Q-Q) 분석기다. 첫 번째 4중극은 질량에 의해 분리되고, 두 번째 4중극에서는 충돌이 일어나고, 세 번째 4중극에서는 파편이 질량에 의해 분리된다.

비행 질량 분석기의 4중극/시간 다이어그램 이온화 소스 샘플은 먼저 쿼드폴 질량 분석기에 들어간 다음 비행 분석기의 시간을 입력한다.

기체크로마토그래피-질량분석법

GCMS 다이어그램 다이어그램은 분석 물질의 경로를 보여준다. 분석 물질은 먼저 기체크로마토그래퍼를 통과한 후 분리된 분석 물질은 질량 분석을 받게 된다. MS에서 사용하는 다른 유형의 질량 분석기 ToF, qudrupole 등이 가능하다.[5]
주요기사 : 기체크로마토그래피-질량분석법

기체크로마토그래피-질량분석(GC-MS)은 기체크로마토그래피의 분리 기법과 질량분석의 식별 기법을 결합한 2차원 크로마토그래피 기법이다. GC-MS는 복잡한 혼합물의 휘발성 및 반휘발성 유기 화합물 분석을 위한 가장 중요한 단일 분석 도구다.[7] 샘플을 GC 입구로 먼저 주입해 기화시켜 기둥을 통해 밀어내는 방식(일반적으로 헬륨)이다. 표본의 분석 물질은 기둥의 코팅, 정지 위상, 반송파 가스 또는 이동 위상과의 상호작용에 기초하여 분리된다.[8] 컬럼에서 용출된 화합물은 질량 분석기를 통과하기 전에 전자 충격(EI) 또는 화학 이온화(CI)를 통해 이온으로 변환된다.[9] 질량 분석기는 질량 대 충전으로 이온을 분리하는 역할을 한다. 인기 있는 선택은 같은 기능을 수행하지만 분리를 달성하는 방법은 다르다.[10] GC-MS와 함께 일반적으로 사용되는 분석기는 비행시간대 질량분석기와 4극질량 분석기는 비행시간 분석기와 4극 질량 분석기다.[8] 분석 물질은 질량 분석기를 떠난 후 검출기에 도달하여 컴퓨터가 읽고 가스 크로마토그램과 질량 스펙트럼을 만드는 데 사용되는 신호를 생성한다. 때때로 GC-MS하고 모호한 기술 GCxGC-ᆩ.[11]궁극적으로, GC-MS는 기술 많은 분석 실험실에 이용되고 매우 adap 효과적이다로 알려진 적절한 봉우리기 위해 그 특정한 종을 할당할 수 있을 상당한 분리 에너지 확보를 위해 특히 복잡한 샘플에서 두개의 가스 chromatographers을 이용한다.)분석 도구

액체 크로마토그래피-질량분석법

주요기사 : 액체 크로마토그래피-질량분석법

액상 크로마토그래피-질량분석(LC/MS)은 고해상도 크로마토그래피 분리를 MS 검출과 결합한다. 시스템이 HPLC의 높은 분리를 채택함에 따라 액체 이동 단계에 있는 분석 물질은 대기압 화학 이온화(APCI), 전기 프레이 이온화(ESI) 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 등 다양한 연성 이온화 방법에 의해 이온화되는 경우가 많으며, 이는 이온화에 필요한 기체 이온화를 실현한다.e MS와의 결합.[citation needed] 이러한 이온화 방법은 GC-MS가 일반적으로 분석할 수 없는 더 큰 질량, 열적으로 불안정한 또는 비휘발성 화합물을 포함하는 광범위한 생물학적 분자의 분석을 가능하게 한다.

LC-MS는 특정 질량을 선택함으로써 해결되지 않은 피크를 분리할 수 있기 때문에 높은 선택성을 제공한다. 또한 질량 스펙트럼에 의해 더 나은 식별이 이루어지며 사용자는 분석 물질의 보존 시간에만 의존할 필요가 없다. 따라서 약품을 개발하고 의약품 제조에 불순물 식별과 정보 수집 등 다양한 분야부터 LC오픈을 했고 MS구조 ch을 제공하는 불순물의 효율적인 분리를 제공한다에 적용될 수 있는 결과, 분자 질량과 구조적 정보뿐만 아니라 양적 데이터 모든 LC-MS.[9]LC-MS을 통해 얻을 수 있다.함께불순물 프로파일링에 대한 [12]행동

LCMS의 다이어그램. 표본은 먼저 HPLC에 의해 분석된 후 질량 분석을 받는다. MS에는 다양한 유형의 질량분석기 ToF, qudrupole 등을 사용할 수 있다.[5]

물, 아세토나이트릴, 메탄올 등 정상상 LC나 역전상 LC에 사용되는 일반 용제는 모두 ESI와 호환되지만 LC 등급 용제는 MS에 적합하지 않을 수 있다. 더욱이 무기 이온이 함유된 완충제는 이온원을 오염시킬 수 있으므로 피해야 한다.[13] 그럼에도 불구하고, 이 문제는 2D LC-MS뿐만 아니라 분석 물질 공해 및 UV 검출 대응을 포함한 다양한 문제들로 해결할 수 있다.[14]

액체 크로마토그래피-액체 크로마토그래피

2차원 액체 크로마토그래피(2D-LC)는 액체 크로마토그래피에 대한 두 개의 별도 분석을 하나의 데이터 분석으로 결합한다. 현대의 2-D 액체 크로마토그래피는 1970년대 후반에서 1980년대 초반에 그 기원을 두고 있다. 이 시기 동안, 2D-LC의 가설 원리는 보충적인 개념적, 이론적 작업과 함께 수행된 실험을 통해 증명되고 있었다. 기존 1차원 액체 크로마토그래피 기법에 비해 2D-LC가 훨씬 더 많은 해결력을 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 1990년대에 2D-LC의 기술은 연구의 프로테오믹스와 폴리머 분야에서 발견되는 극도로 복잡한 물질과 물질의 분리에 중요한 역할을 했다. 불행히도, 이 기술은 분석 시간에 있어서 상당한 단점이 있는 것으로 나타났다. 2D-LC를 사용한 초기 작업은 기계의 분석 시간이 길기 때문에 액체 위상 분리의 작은 부분으로 제한되었다. 현대적인 2D-LC 기술은 이러한 단점을 정면으로 다루었고, 한 때 손상된 특징이었던 것을 현저하게 감소시켰다. 모던한 2D-LC는 고해상도 분리가 1시간 이내에 완료되도록 하는 도구적 용량을 가지고 있다. 검출 한도를 높이고 복잡성이 커지는 물질에 대한 분석을 수행하기 위한 계측기 필요성이 커짐에 따라 2D-LC 개발이 추진되고 있다. 기악 부분은 주류 산업의 초점이 되었고 이전보다 훨씬 쉽게 달성되었다. 이에 앞서 2D-LC는 1D-LC 계측기의 구성품을 사용하여 수행되었으며 정확도와 정밀도가 모두 달라지는 결과를 초래했다. 기악공학에 대한 스트레스 감소로 2D-LC의 분야와 기법의 선구자가 가능해졌다.

이 기법을 사용하는 목적은 1차원 액체 크로마토그래피로는 효과적으로 분리할 수 없는 혼합물을 분리하는 것이다. 2차원 액체 크로마토그래피는 소변, 환경 물질, 혈액과 같은 법의학적 증거와 같은 복잡한 혼합물 샘플을 분석하는 데 더 적합하다.

혼합물을 분리하는 데 어려움이 있는 것은 혼합물의 서로 다른 배출물의 수로 인해 분리가 발생할 수 없다는 점에서 혼합물의 복잡성에 기인할 수 있다. 1차원 액체 크로마토그래피와 관련된 또 다른 문제는 밀접하게 관련된 화합물들의 해결과 관련된 어려움을 포함한다. 밀접하게 연관된 화합물은 극성, 전하 등에 근거해 분리하기 어려운 화학적 성질을 가질 수 있다.[15] 2차원 액체 크로마토그래피는 둘 이상의 화학적 또는 물리적 성질을 기반으로 분리를 제공한다. Nagy와 Vekey의 예를 들면, 펩타이드의 혼합물은 그 기본성에 따라 분리될 수 있지만, 유사한 펩타이드들은 잘 용출되지 않을 수도 있다. 후속 LC 기법을 사용하면 펩타이드 간의 유사한 기본성을 아폴라 성질의 차이를 채택하여 더욱 분리할 수 있다.[16]

결과적으로 혼합물을 더 효율적으로 분리할 수 있도록 후속 LC 분석은 첫 번째 열에 비해 매우 다른 분리 선택도를 채택해야 한다. 부쉬와 조르겐슨에 따르면 2D 액체 크로마토그래피를 효과적으로 사용하기 위한 또 다른 요건은 두 분리 기법이 가능한 한 달라야 한다는 것을 의미하는 고직교 기법을 채택하는 것이다.[17]

1차원 LC의 도표. 이 기법의 스펙트럼 결과의 예도 보여진다.[15]
2차원 LC의 도표. 이 특정 기법의 스펙트럼 결과의 예도 제시된다.[15]

2D 액체 크로마토그래피에는 크게 두 가지 분류가 있다. 여기에는 다음이 포함된다. 종합적인 2D 액체 크로마토그래피(LCxLC) 및 하트 커팅 2D 액체 크로마토그래피(LC-LC)[18] 종합적인 2D-LC에서는 한 컬럼 용출의 모든 피크가 완전하게 샘플링되지만, 첫 번째 컬럼에서 두 번째 컬럼으로 전체 샘플을 이전할 필요는 없다고 간주되어 왔다. 샘플의 일부는 폐기물로 보내지고 나머지는 샘플링 밸브로 보내진다. 심장을 절단하는 2D-LC에서 특정 피크는 두 번째 열에 주입되는 피크의 일부만 대상으로 한다. 심장을 절단하는 2D-LC는 유사한 보존 동작을 갖는다면 그다지 복잡하지 않은 물질의 샘플 분석에 상당히 유용한 것으로 입증되었다. 종합적인 2D-LC에 비해, 하트 컷팅 2D-LC는 시스템 설정이 훨씬 적고 운영비가 훨씬 저렴한 효과적인 기술을 제공한다. 다중심장절단(mLC-LC)을 사용하여 2차원 분석의 일시적 중첩 위험을 감수하지 않고 1차원 분석으로부터 복수 피크를 샘플링할 수 있다.[18] 다중 심장절단(mLC-LC)은 다중 샘플링 루프의 설정을 이용한다.

2D-LC의 경우 최대 용량이 매우 중요한 문제다. 이것은 합리적인 시간이 주어진 이소크라테스 분리보다 훨씬 더 큰 효율을 가진 구배 용출 분리를 사용하여 생성될 수 있다. 이소크라테스 용출은 빠른 시간 척도에서는 훨씬 쉽지만, 두 번째 차원에서는 경사 용출 분리를 수행하는 것이 바람직하다. 이동상 강도는 약한 용출성 구성부터 강한 구성까지 다양하다. 역상 크로마토그래피에 대한 경사도 용출의 선형용매강도이론(LST)을 바탕으로 보존시간, 기악변수, 용액변수의 관계를 이하에 나타낸다.[18]

tR=t0 +tD + t0/b*ln(b*(k0-td/t0) + 1)

2D-LC가 주요 분석 크로마토그래피 기법이 된 이후 몇 년 동안 많은 선구적인 연구가 완료되었지만, 여전히 고려해야 할 현대적인 문제들이 많다. 아직 다량의 실험 변수가 결정되지 않았고, 기법은 끊임없이 발전하는 상태에 있다.

가스 크로마토그래피 - 가스 크로마토그래피

종합 2차원 가스 크로마토그래피는 복합 혼합물을 분리해 분석하는 분석 기법이다. 향료, 향료, 환경 연구, 제약, 석유 제품, 법의학 등의 분야에서 활용되었다. GCxGC는 높은 감도 범위를 제공하며 피크 용량 증가로 인해 더 큰 분리 전력을 생산한다.

참고 항목

참조

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