메타트랜스크립토믹스

Metatranscriptomics

메타트랜스크립토믹스는 자연환경 내에서 미생물의 유전자 발현, 즉 메타트랜스크립토메틱을 연구하는 과학이다. 그것은 또한 복잡한 미생물 집단의 유전자 발현 프로파일링을 얻을 수 있게 한다.[1]

메타게노믹스는 게놈의 내용을 연구하고 공동체 내에 어떤 미생물이 존재하는지 확인하는 데 초점을 맞추는 반면 메타트랜스크립토믹스는 그러한 공동체 내에서 활성 유전자의 다양성을 연구하고, 그들의 표현 수준을 정량화하고, 이러한 수준이 다른 조건(예: 생리적 대 팻)에서 어떻게 변화하는지 감시하는 데 사용될 수 있다.유기체의 생물학적 조건. 메타트랜스크립토믹스의 장점은 미생물 집단의 활성기능의 차이에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 미생물 구성의 측면에서도 동일해 보인다.[2]

소개

마이크로바이옴은 잘 정의된 서식지를 점유하는 미생물 집단으로 정의되어 왔다.[3] 그것들은 어디에나 있으며" 그들이 거주하는 환경의 특징과 이러한 지역사회의 불균형은 그들이 거주하는 환경의 활동에 부정적인 영향을 미칠 수 있다"의 유지에 매우 목적적합하다. 이러한 커뮤니티를 연구하고, 그 커뮤니티가 틈새에 미치는 영향과 상관관계를 판단하기 위해, 서로 다른 오믹스 접근법이 사용되어 왔다. 메타게노믹스는 표본의 분류학적 프로파일을 얻을 수 있는 반면 메타크릭토믹스는 어떤 유전자가 커뮤니티에 의해 표현되는지를 분석함으로써 기능적 프로파일을 제공한다. 특정 조건에서 어떤 유전자가 발현되는지를 유추할 수 있으며, 이는 발현된 유전자의 기능적 주석을 이용하여 할 수 있다.

함수

메타트랜스크립토믹스는 어떤 유전자가 표현되는가에 초점을 맞추고 있기 때문에 전체 미생물 집단의 활성 기능 프로파일을 이해할 수 있게 한다.[4] 주어진 샘플에서 유전자 발현 개요는 마이크로바이옴의 총 mRNA를 캡처하고 전체 메타트랜스크립토믹스 샷건 시퀀싱을 수행하여 얻는다.

도구 및 기술

일부 모델 유기체의 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 마이크로레이를 이용할 수 있지만, 차세대 염기서열 분석과 3세대 염기서열 분석에서 선호되는 기법이다. 메타트랜스펙트럼 분석을 수행하는 데 사용되는 프로토콜은 분석이 필요한 샘플 유형에 따라 달라질 수 있다. 실제로, 미생물 샘플의 메타트랜스펙트럼ome을 연구하기 위해 많은 다양한 프로토콜이 개발되었다. 일반적으로 단계에는 샘플 채취, RNA 추출(문헌에 보고된 여러 종류의 샘플에 대한 다른 추출 방법), mRNA 농축, cDNA 합성 및 메타트랜스크립토믹 라이브러리의 준비, 시퀀싱 및 데이터 처리 및 분석이 포함된다.mRNA 농축은 가장 까다로운 부분 중 하나이다. 다음과 같은 다양한 전략이 제안되었다.

  • 리보솜 RNA 캡처를 통해 rRNA 제거
  • 5-3 exonuclease를 사용하여 처리된 RNA(대부분 rRNA 및 tRNA)[5]의 성능 저하
  • 폴리A 중합효소(대장균)를 사용하여 mRNA에 폴리(A) 추가
  • 항체를 사용하여 특정 단백질과 결합하는 mRNA를 포획함

최근 두 가지 전략은 편향성이 높은 것으로 보고돼 추천하지 않는다.[6]

계산분석

일반적인 메타트랜스펙트럼 분석 파이프라인:

  • 지도는 참조 게놈으로 읽는다.
  • 대본 콘티그와 초 콘티그로 읽기의 노보 조립을 수행한다.

첫 번째 전략 맵은 데이터베이스에 있는 게놈을 참조하고, 단일 유전자의 상대적 표현을 추론하는 데 유용한 정보를 수집하기 위해 읽는다. 메타트랜스펙터콤 읽기는 Bowtie2, BWA, VLAST와 같은 정렬 도구를 사용하여 데이터베이스에 대해 매핑된다. 그런 다음 GO, KEGG, COG, 스위스 프로트 등의 자원을 이용해 결과를 주석으로 달게 된다. 연구목적에 따라 최종 결과분석을 실시한다. 최근의 메타트랜스크립토믹스 기법 중 하나는 안정적 동위원소 프로빙(SIP)인데, 이것은 호수 침전물에서 에어로빅 미생물의 특정 표적형 성적표(targeted transcriptom)를 검색하는 데 사용되어 왔다.[7] 이 전략의 한계는 데이터베이스에 있는 참조 게놈 정보에 대한 의존이다.

두 번째 전략은 메타트랜스펙터콤 리드를 다른 소프트 웨어를 사용하여 콘티그라고 불리는 긴 조각으로 조립함으로써 다른 유전자의 표현의 풍부함을 찾아낸다. 그래서 그것의 한계는 조립에 사용되는 소프트웨어에 달려있다. RNA-seq용 트리니티 소프트웨어는 다른 de novo transcriptom assemblyers와 비교하여 게놈 정렬에 의존하는 방법과 유사한 민감도로 광범위한 표현 수준에서 더 많은 전체 길이의 대본을 복구하는 것으로 보고되었다. 이것은 참조 게놈의 부재에 특히 중요하다.[8]

대본 분석을 위한 정량적 파이프라인은 Li와 Dewey가 개발했으며 RSEM(RNA-Seq by Prepective Maximization)이라고 불린다. 독립형 소프트웨어 또는 트리니티용 플러그인으로 작동할 수 있다. RSEM은 시료에서 생성된 RNA-Seq 읽기와 함께 참조 대본 또는 어셈블리로 시작하여 표준화된 대본 풍부함을 계산한다(RNA-Seq 읽기 수는 각 기준 대본 또는 어셈블리에 대응된다).[10][11]

트리니티와 RSEM은 모두 대본 데이터셋(즉, 단일 유기체에서 얻어진)을 위해 설계되었지만, 이를 메타트랜스펙토믹 데이터(즉, 전체 미생물 집단에서 얻어진 데이터)에 적용하는 것이 가능할 수 있다.[12][13][14][15][16][17]

생물정보학

메타게놈 분석과 메타트랜스펙토믹 분석에서 얻은 엄청난 양의 데이터를 감안할 때, 생물정보 도구의 사용은 지난 수십 년 동안 더욱 중요해졌다. 이를 위해 HUMAN과 가장 최근의 HUMAN2, 메타트랜스, SAMSA, Leimena-2013, mOTUs2와 같은 오픈 소스 플랫폼으로서 많은 다양한 생물정보 파이프라인이 개발되었다.[18]

HUMAN2

HUMAN2는 HMP(Human Microbiome Project) 동안 개발된 후기 HUMAN에서 "계층 검색" 접근법을 구현하여 설계된 생물정보 파이프라인이다. 첫 번째 계층에서 HUMAN2는 이미 알려진 미생물을 식별하고 주석 처리된 종의 판게놈을 병합하여 샘플별 데이터베이스를 구축하기 위해 MetaPhlAn2와 함께 DNA 또는 RNA 판독치를 차단하고, 두 번째 계층에서 알고리즘은 조립된 판게놈 데이터베이스에 대한 판독값의 매핑을 수행하고, 세 번째 계층에서 비 정렬 판독값은 u이다.단백질 데이터베이스에 대한 번역된 검색을 위해 sed.[19]

메타트랜스

메타트랜스는 메타게놈과 메타트랜스펙토믹 분석을 개선하기 위해 멀티스레딩 컴퓨터를 활용하는 파이프라인이다. 데이터는 쌍체 종단 RNA-Seq로부터 얻으며, 주로 분류학에서는 16S RNA, 유전자 발현 수준에서는 mRNA로부터 얻는다. 송유관은 크게 4단계로 나뉜다. 첫째, 쌍방향 판독은 품질 관리 목적으로 필터링되며, 이후 분류학적 분석(tRNA 시퀀스 제거) 또는 기능 분석(tRNA 및 rRNA 시퀀스 제거)을 위해 정렬된다. 분류학 분석의 경우 SOAP2를 사용하여 16S rRNA Greengenenes v13.5 데이터베이스에 대해 시퀀스를 매핑하는 반면, 기능 분석의 경우 SOAP2 도구를 사용하여 항상 MetaHIT-2014와 같은 기능 데이터베이스를 기준으로 시퀀스를 매핑한다. 이 파이프라인은 일반적인 구조가 보존되는 한 제3자 툴을 사용하고 단일 모듈을 개선할 수 있는 가능성을 제공하기 때문에 유연성이 높다.[20]

삼사

이 파이프라인은 메타게노믹스용 MG-RAST 서버와 연동하여 메타테크노믹스 데이터 분석을 위해 특별히 설계되었다. 이 파이프라인은 사용이 간편하고 기술 준비와 연산 능력이 부족하며 광범위한 미생물에 적용할 수 있다. 알고리즘은 4단계로 나뉜다. 처음에는 원시 시퀀싱 데이터의 시퀀스를 품질 기준으로 선택한 다음 MG-RAST에 제출한다(품질 관리 검사, 유전자 호출, 아미노산 시퀀스 클러스터링, 최적의 일치 여부를 감지하기 위한 각 클러스터의 sBLAT 사용 등 다른 단계를 예상). 그런 다음, 일반적으로 프로세스의 마지막 단계로 후속되는 분류학 및 기능 분석 목적을 위해 일치를 집계한다.[21]

라이메나-2013

이 파이프라인은 실제로 이름이 없기 때문에 대개 그것이 묘사되는 글의 작성자의 이름으로 간주된다. 이 알고리즘은 블라스트, 메가BLAST와 같은 정렬 도구의 구현을 예측한다. 일반적으로 Illumina 시퀀싱에 의해 얻어진 리드는 동일한 읽기 군집으로 군집화된 다음 t-RNA 및 r-RNA 시퀀스의 실리 내 제거를 위해 처리된다. 그런 다음 나머지 읽기는 블라스트 및 MegaBLAST 도구를 사용하여 NCBI 데이터베이스에 매핑되고 비트코어로 분류된다. 따라서 높은 비트코어 시퀀스는 계통 발생 원인과 기능을 예측하기 위해 해석된다. 대신 낮은 점수 판독은 블라스트X(고감도)와 정렬되며, 결국 단백질 데이터베이스에서 정렬할 수 있어 기능이 특화될 수 있다.[12]

mOTUs2

필수 하우스키핑 유전자를 기반으로 [22]한 mOTUs2 프로파일러는 미생물 공동체 구성원의 기저 전사 활동을 계량화하는 데 적합하다. 환경조건에 따라 세포당 성적증명서의 수는 대부분의 유전자에 따라 다르다. 이에 대한 예외는 다른 조건에서 구성적으로 표현되고 변동성이 낮은 하우스키핑 유전자다. 따라서, 그러한 유전자의 증상의 풍부함은 공동체의 활성 세포의 풍부함과 강하게 연관된다.

마이크로레이

메타트랜스펙터콤의 목적으로 이용될 수 있는 또 다른 방법은 타일링 마이크로아레이이다. 특히, 미생물 전사 수준을 측정하고, 새로운 대본을 검출하고, mRNA의 구조(예를 들어, UTR 경계)에 대한 정보를 얻기 위해 미생물 전사 수준을 측정하는 데 마이크로레이가 사용되어 왔다. 최근에는 새로운 규제 ncRNA를 발굴하는 데도 활용되고 있다. 그러나 미세 광선은 몇 가지 함정의 영향을 받는다.

  • 프로브 설계 요건
  • 낮은 민감도
  • 유전자 표적에 대한 사전 지식

RNA-Seq는 분석해야 하는 게놈에 대한 사전 지식이 필요하지 않고 유전자 예측, 구조, 표현에 대한 높은 처리량 검증을 제공하는 등 이러한 한계를 극복할 수 있다. 따라서, 두 접근법을 결합함으로써 박테리아 성적 증명서의 보다 완전한 표현을 할 수 있다.[1]

제한 사항

  • 리보솜 RNA는 그것의 지배적인 풍부함으로, 총 수집된 RNA에서 mRNA (transcriptomic studies의 주요 초점)의 커버리지를 강하게 감소시킨다.
  • 일부 생물학적 또는 환경적 샘플(대변 등)에서 고품질 RNA를 추출하는 것은 어려울 수 있다.
  • 시퀀싱 전에 샘플 무결성을 손상시키는 mRNA의 불안정성.
  • 실험 문제는 여러 표본 간의 식 차이 정량화에 영향을 미칠 수 있다. 그것들은 샘플, 크기 섹션 및 유전자 모델에 남아 있는 rRNA의 양뿐만 아니라 무결성과 입력 RNA에 영향을 미칠 수 있다. 게다가 분자 염기 기법은 실제적인 영향을 받기 쉽다.
  • 미생물 농축을 위한 상업용 키트를 사용할 수 있지만 숙주와 미생물 RNA를 구별하는 데 어려움이 있음. 이것은 또한 호스트에 대한 참조 게놈을 사용할 수 있는 경우 실리코에서도 수행될 수 있다.
  • 성적 증명서 참조 데이터베이스는 범위가 제한되어 있다.
  • 일반적으로 많은 세포 집단이 메타트랜스펙토믹 분석에 이용되기 때문에 하위집합 사이에 존재할 수 있는 중요한 분산을 해결하기 어렵다. 사실, 병원체 모집단의 높은 변동성은 질병의 진행과 독성에 영향을 미치는 것으로 입증되었다.
  • 마이크로어레이와 RNA-Seq 둘 다 유전자 발현에서 동역학 범위가 높아 유전자를 'express'로 간주하기 위해 실제 '컷오프'를 설정하기는 어렵다.
  • mRNA의 존재는 항상 각각의 단백질의 실제 존재와 관련이 있는 것은 아니다.[1]

적용들

인체 내장 마이크로바이옴

참고 항목: 구트마이크로바이오타

내장 마이크로바이옴은 최근 몇 년간 인간의 건강에 중요한 역할을 하는 존재로 부상했다. 그것의 보편적인 기능은 소화가 잘 안 되는 음식의 발효, 병원체와의 경쟁, 장막 강화, 면역체계의 자극과 조절과 관련이 있다.[23][24][25][26][27][28][29] 비록 지난 몇 년 동안 마이크로바이옴 공동체에 대해 많은 것을 배웠지만, 내장에 있는 미생물과 분자의 광범위한 다양성은 새로운 발견을 가능하게 하는 새로운 도구를 필요로 한다. 유전자의 발현 변화에 집중함으로써 메타그래픽노믹스는 메타게노믹스보다 마이크로바이옴의 상태와 활동을 더 역동적으로 찍을 수 있게 한다. 메타테크닉 기능 프로파일은 메타게놈 정보로만 간주되었을 수 있는 것보다 더 가변적이라는 것이 관찰되었다. 이는 비주거 유전자가 안정되게[30][31] 표현되지 않음을 시사한다.

메타트랜스펙토믹 적용의 한 예는 염증성 장 질환의 내장 마이크로바이옴 연구에 있다. 염증성 장질환(IBD)은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 소화관의 만성 질환의 집단이다.[32] 몇몇 인간의 유전적 돌연변이는 IBD에 대한 민감성 증가와 연관되어 있지만, 이 질병의 완전한 발전을 위해서는 추가적인 요소들이 필요하다.

IBD와 장내 미생물 사이의 관계에 대해서는 IBD를 가진 환자에게서 난이도가 있는 것으로 알려져 있으나, 미생물 분류 프로파일은 환자들 사이에 차이가 매우 크기 때문에 특정 미생물종이나 질병의 발생과 진행에 있어서 균주를 연관시키기가 어렵다. 또한 장내 미생물 구성은 IBD를 가진 환자의 변이가 더 뚜렷하게 나타나며, 시간이 지남에 따라 사람 사이에 높은 변동성을 나타낸다.[33][34] 유기체의 기능적 잠재력, 즉 게놈으로 부호화된 유전자와 경로를 의미하며, 그러한 기능의 활성화 수준이나 정도에 대한 간접적인 정보만 제공한다. 그래서 장내 미생물 이상증(microbiom disbiosis)의 메커니즘을 이해하기 위해서는 기능활동(gene 표현)의 측정이 매우 중요하다.

rRNA 표현에 확립된 IBD의 전사적 활성의 변경은 IBD가 있는 환자에서 일부 박테리아 집단이 활성 상태인 반면 다른 집단은 비활성 또는 잠재되어 있음을 나타낸다.[35]

장내 마이크로바이옴의 기능 활성을 측정하는 메타트랜스크립토믹스 분석은 IBD에 대한 질병 관련 관찰을 포함하여 메타게놈 기능적 잠재력에서 부분적으로만 관측할 수 있는 통찰력을 보여준다. 많은 IBD 고유 신호는 RNA 수준에서 더 뚜렷하거나 또는 검출만 가능한 것으로 보고되었다.[33] 이러한 변화된 표현 프로파일은 IBD 환자의 장 환경의 변화로 인해 발생할 수 있으며, 여기에는 염증 수준 증가, 산소 농도 증가, 점막층 감소 등이 포함된다.[36] 메타트랜스크립토믹스는 (점액이나 산소처럼) 현장에서 생화학적 제품의 검사를 생략할 수 있는 장점이 있으며, 대규모 인구를 대상으로 환경 변화가 생체내 미생물 발현 패턴에 미치는 영향을 연구할 수 있다. 또한, 종방향 샘플링과 결합하여 활동 변조를 질병 진행과 연관시킬 수 있다. 실제로 특정 경로가 게놈 수준에서 시간이 지남에 따라 안정적일 수 있지만, 해당 표현은 질병의 심각도에 따라 달라지는 것으로 나타났다.[33] 이것은 미생물 이상균이 안정적인 지역사회에서 전사 프로그램의 변화를 통해 장 건강에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 이와 같이 메타인크립토믹 프로파일링은 그 관계의 메커니즘을 이해하는 중요한 도구로 등장한다.

대변에 있는 RNA 측정의 기술적 제한은 추출된 RNA가 분해될 수 있다는 사실과 관련이 있으며, 그렇지 않다면 여전히 대변 샘플에 존재하는 유기체만을 나타낸다.

기타

  • 지시 배양: 적절한 배양 배지를 준비하기 위해 유기체의 영양적 선호도를 이해하는데 사용되어 체외 미생물의 성공적인 격리를 가져왔다.[1]
  • 특정 자극 후 관련 변종이나 종의 서로 다른 전사적 반응을 비교하기 위해 비교대사체학을 통해 잠재적 자극 요인을 확인한다.
  • 호스트별 생물학적 과정과 상호작용을 식별하라 이 목적을 위해, 일부 유전자의 발현 수준의 변화를 동시에 검출할 수 있는 새로운 기술을 개발하는 것이 중요하다.

적용된 기술의 예: 마이크로레이: 숙주와 병원체 모두에 대해 많은 유전자의 발현 수준의 변화를 동시에 모니터링할 수 있다. 첫 번째 마이크로 어레이 접근법은 비브리오콜레라, 보렐리아 버그도페리, 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 폐렴, 살모넬라균 등 병원균의 유전자 발현 변화를 전지구적으로 최초로 분석하여 이들 미생물이 숙주에 적응하기 위해 사용하는 전략을 밝혀냈다. 또한 미세선은 세균 감염이 다양한 숙주 인자의 발현에 미치는 영향으로서 PAMP에 대한 숙주 선천적인 면역 반응에 대한 첫 번째 글로벌 통찰력만을 제공한다. 어쨌든 두 유기체의 미세선을 통해 동시에 검출되는 것은 문제가 될 수 있다. 문제:

  • 프로브 선택(수억 개의 서로 다른 프로브)
  • 교차 하이브리드화
  • 값비싼 칩의 필요성(적절한 설계, 고밀도 어레이
  • 유전자 발현 분석 전에 병원체와 숙주세포를 물리적으로 분리할 것을 요구한다(eukaryotic cells의 transcriptoms는 병원균의 transcriptoms에 비해 크기 때문에 병원균의 RNA에서 나오는 신호가 숨겨져 있을 수 있다).
  • 진핵 세포 투석 중 RNA 분자의 손실.

이중 RNA-Seq: 이 기술은 호스트와 병원체 대본의 동시 연구도 가능하게 한다. 감염 과정의 서로 다른 시점에서 유전자의 발현을 감시할 수 있다. 이렇게 하면 초기 접촉에서 숙주의 조작까지 양쪽 유기체의 세포 네트워크의 변화를 연구할 수 있을 것이다(인터플레이 호스트-패토겐(interplay host-patogen).

  • 잠재력: 비싼 칩 필요 없음
  • 프로브 독립적 접근방식(RNA-seq는 mRNA 시퀀스에 대한 사전 지식 없이 스크립트 정보 제공)
  • 높은 민감도.
  • 서로 다른 조건에서 미지의 유전자도 발현 정도를 연구할 수 있는 가능성

더욱이 RNA-Seq는 병원체 게놈의 조직화가 오퍼슨으로 가능하게 하면서, 코어질 유전자를 식별하는 중요한 접근법이다. 사실, 게놈 주석은 칸디다 알비칸, 트라이파노소마 브루시, 플라모디움 팔시파룸과 같은 몇몇 진핵 병원체에 대해 수행되었다.

현재 이용 가능한 염기서열의 민감도와 깊이가 증가함에도 불구하고, 포유류 숙주세포의 감염 반응에 관한 RNA-Seq 연구는 아직 거의 발표되지 않았다.[37][38]

참조

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