멀티로커스 시퀀스타이핑

Multilocus sequence typing

Multilocus Sequence Typing(MLST)은 분자생물학에서 여러 개의 하우스키핑 유전자의 내부 조각의 DNA 시퀀스를 사용하여 미생물 종의 분리를 특징짓습니다.

최초로 개발된 MLST 체계는 뇌수막염과 패혈증의 원인 물질인 Neisseria Meningitidis를 [1]위한 것이었다.MLST는 진화사 연구를 위해 도입된 이래 인간 병원체뿐만 아니라 식물 [2]병원체에도 사용되어 왔다.

원칙

MLST는 일련의 하우스키핑 유전자의 DNA 배열 변화를 직접 측정하고 고유한 대립 유전자 프로파일로 균주를 특징짓습니다.MLST의 원리는 간단하다: 이 기술은 PCR 증폭과 DNA 염기서열 분석을 수반한다.균주 간의 뉴클레오티드 차이는 원하는 식별 정도에 따라 다양한 유전자 수로 확인할 수 있다.

MLST의 워크플로우에는 1) 데이터 수집, 2) 데이터 분석 및 3) 다중 초점 시퀀스 분석이 포함됩니다.데이터 수집 공정에서는 유전자 단편의 뉴클레오티드 배열 결정에 의해 변이의 확정적인 식별을 얻는다.데이터 해석 스텝에서는, 모든 고유 배열에 대립 유전자 번호를 할당해, 대립 유전자 프로파일로 조합해 배열 타입(ST)을 할당한다.새로운 대립 유전자와 ST가 발견되면 검증 후 데이터베이스에 저장됩니다.MLST의 최종 분석 단계에서는 대립 유전자 프로파일을 비교하여 절연체의 관련성을 구한다.연구자들은 서로 다른 클론 복합체의 ST를 비교함으로써 역학 및 계통학 연구를 한다.염기서열결정 및 식별 프로세스 중에 대량의 데이터가 생성되므로 모든 생물학적 데이터를 배열, 관리, 분석 및 병합하기 위해 생체정보 기술이 사용됩니다.

균주 타입의 허용 가능한 식별력, 시간, 비용 사이의 균형을 맞추기 위해 약 7~8개의 하우스키핑 유전자가 실험실에서 일반적으로 사용된다.예를 들어 황색포도상구균을 예로 들며 MLST 타이핑에는 7개의 하우스키핑 유전자가 사용된다.이러한 유전자에는 MLST 웹사이트에 명시된 바와 같이 카르바메이트 키나제(arcC), 식칼리산탈수소효소(aroE), 글리세롤 키나제(glpF), 구아닐산 키나제(gmk), 인산아세틸전달효소(pta), 삼인산 이성질화효소(tpi) 및 아세틸조효소 A 아세틸전달효소(yqiL)가 포함된다.그러나 하우스키핑 유전자가 10개까지 사용되는 것은 드문 일이 아니다.Vibrio vulnificus는 글루코오스-6-인산 이성질화효소(glp), DNA 자이라아제, 서브유닛B(gyrB), 말산락틴탈수소효소(mdh), 메티오닐-tRNA합성효소(METG), 포스포리보시라미니다졸합성효소(PurMRETONA)이다.디히드로오로타아제(pyrC) 및 트립토파나아제(tnaA)입니다.따라서 MLST에 의해 조사된 하우스키핑 유전자의 수와 유형은 종마다 다를 수 있다.

이들 하우스키핑 유전자 각각에 대해 서로 다른 배열이 대립 유전자로 할당되어 위치에서의 대립 유전자가 대립 유전자의 프로파일을 제공한다.그러면 일련의 프로파일이 변형률 입력의 식별 마커가 될 수 있습니다.단일 뉴클레오티드라도 다른 배열은 다른 대립 유전자로 할당되며, 복수의 뉴클레오티드 부위의 차이가 다중점 돌연변이의 결과인지 단일 재조합 교환의 결과인지 구별할 수 없기 때문에 대립 유전자들 간의 뉴클레오티드 차이를 고려하는 가중치는 부여되지 않는다.각 위치의 많은 잠재적 대립 유전자는 수십억 개의 다른 대립 유전자의 프로파일을 구별할 수 있는 능력을 제공하며, 각 위치에서 가장 일반적인 대립 유전자가 있는 변종은 약 10,000개의 분리주 [citation needed]중 한 번만 우연히 발생할 것으로 예상됩니다.MLST가 높은 식별력을 제공함에도 불구하고 하우스키핑 유전자의 뉴클레오티드 변화 축적은 비교적 느린 과정이며, 시간이 지남에 따라 세균 분리체의 대립 형상이 안정되어 있어 글로벌 역학에서 이상적인 방법이다.

절연체의 관련성은 대립 유전자 프로파일, eBURST 또는 최소 스패닝 트리(MST) 사이의 쌍별 차이 매트릭스를 사용하여 구성된 덴드로그램으로 표시됩니다.덴드로그램은 공통의 조상으로부터 파생된 것으로 추정될 수 있는 동일하거나 매우 유사한 대립 유전자 프로파일을 가진 고립체를 표시하는 편리한 방법일 뿐입니다. 7개의 위치 중 3개 이상에서 다른 고립체 간의 관계는 신뢰할 수 없으며 그들의 계통 [3][4]발생을 추론하기 위해 채택되어서는 안 됩니다.MST는 트리의 모든 분기의 합계 거리가 [5]최소가 되도록 모든 샘플을 연결합니다.

또는 MultiLocus Sequence Analysis(MLSA)를 사용하여 절연체의 관련성을 분석할 수도 있다.이것은 할당된 대립 유전자를 사용하는 것이 아니라 하우스키핑 유전자의 유전자 조각의 염기서열을 연결하고 이 연결된 염기서열을 사용하여 계통발생 관계를 결정합니다.MLST와 대조적으로, 이 분석은 단일 뉴클레오티드만 다른 배열들 사이에 더 높은 유사성과 다중 뉴클레오티드 차이를 가진 배열들 사이의 더 낮은 유사성을 부여한다.결과적으로, 이 분석은 복제 진화를 가진 유기체에 더 적합하며, 재조합 사건이 매우 자주 발생하는 유기체에는 덜 적합하다.그것은 또한 밀접하게 연관된 [6]종들 사이의 계통학적 관계를 결정하는 데 사용될 수 있다.MLST와 MLSA라는 용어는 교환 가능한 것으로 간주되는 경우가 많습니다.그러나 각 분석 방법에는 고유한 특징과 용도가 있기 때문에 이는 옳지 않다.올바른 용어를 사용할 수 있도록 주의해야 합니다.

다른 기술과의 비교

이전의 혈청학적 유형 접근법은 세균 분리체를 구별하기 위해 확립되었지만, 면역학적 유형에는 소수의 항원적 위치에 대한 의존성과 다른 항원 변형을 가진 항체의 예측할 수 없는 반응성과 같은 단점이 있다.펄스 필드 겔 전기영동(PFGE), 리보타이핑 및 PCR 기반 지문과 같은 병원체의 관련성을 결정하기 위해 여러 분자 유형 방식이 제안되었다.그러나 이러한 DNA 밴딩 기반의 서브타이핑 방법은 의미 있는 진화적 분석을 제공하지 않습니다.PFGE는 많은 연구자들에 의해 "금본위제"로 간주되고 있지만, 많은 변종들은 공정 중 DNA의 분해(겔 도말)로 인해 이 기술로 형상이 불가능하다.

MLST의 접근법은 다중핵심대사효소의 서로 다른 전기영동성(EM)에 기초한 다중궤적효소 전기영동(MLE)과는 다르다.각 궤적의 대립 유전자는 효소들 사이의 다른 아미노산 배열이 겔 위에서 실행될 때 다른 이동성과 뚜렷한 띠를 야기하기 때문에 그들의 생성물의 EM을 정의합니다.절연체의 관련성은 전기영동 유형 간의 쌍별 차이 매트릭스에서 생성된 덴드로그램으로 시각화할 수 있다.이 방법은 여러 가지 이유로 MLST보다 분해능이 낮으며, 모두 효소적 표현형 다양성이 DNA 배열 다양성의 대용물일 뿐이라는 사실에서 발생한다.첫째, 효소는 다른 EM을 가지지 않고 다른 아미노산 배열을 가질 수 있다.둘째, "침묵한 돌연변이"는 암호화된 아미노산을 바꾸지 않고 유전자의 DNA 서열을 바꿀 수 있다.셋째, 효소의 표현형은 환경 조건에 따라 쉽게 변경될 수 있으며 MLEE 결과의 재현성에 나쁜 영향을 미친다. 즉, 효소의 일반적인 변형은 인산화, 보조인자 결합 및 운반 서열의 분할이다.이것은 또한 다른 실험실에서 얻은 MLEE 데이터의 비교 가능성을 제한하는 반면, MLST는 휴대 가능하고 비교 가능한 DNA 배열 데이터를 제공하며 자동화 및 표준화의 가능성이 크다.

MLST는 DNA 바코딩과 혼동하지 마십시오.후자는 진핵생물의 특정 종을 인식하기 위해 짧은 유전자 표지를 사용하는 분류학적 방법이다.그것은 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 또는 리보솜 DNA 시스트론의 일부가 비교적 빠른 돌연변이율을 가지고 있다는 사실에 기초하고 있다. mtDNA 방법은 진핵생물에서만 가능하다(원핵생물에는 미토콘드리아가 없기 때문에). 반면 MLST는 원핵생물용으로 처음 개발되었지만 현재는 fi이다.진핵생물에서의 nding 적용과 원칙적으로 모든 왕국에 적용될 수 있다.

장점과 응용 프로그램

MLST는 매우 명확하고 휴대성이 뛰어납니다.ST 결정에 필요한 재료는 실험실 간에 교환할 수 있다.프라이머 시퀀스 및 프로토콜은 전자적으로 액세스할 수 있습니다.재현성과 확장성이 있습니다.MLST는 자동화되어 높은 처리량 시퀀싱 및 생물 정보학의 진보와 확립된 집단 유전학 기술을 결합합니다.MLST 데이터를 사용하여 박테리아 간의 진화적 관계를 조사할 수 있습니다.MLST는 절연체를 구별하기 위한 뛰어난 식별력을 제공합니다.

MLST의 응용은 거대하며 식품 산업뿐만 아니라 과학, 공중 보건, 수의학 커뮤니티에 자원을 제공합니다.다음으로 MLST 어플리케이션의 예를 나타냅니다.

캄필로박터

캄필로박터는 세균성 장질환의 일반적인 원인물질로, 보통 덜 익은 가금류나 살균되지 않은 우유에서 발생한다.그러나 발병이 거의 감지되지 않아 역학이 제대로 파악되지 않아 발생원이나 전염경로가 쉽게 추적되지 않는다.또한 Campylobacter 게놈은 유전자적으로 다양하고 불안정하며, 유전자 간 및 유전자 내 재조합이 빈번하게 이루어지며, 상변화와 함께 많은 타이핑 방법에서 데이터 해석을 복잡하게 한다.최근까지 MLST 기술을 적용하여 Campylobacter 타이핑이 큰 성공을 거두어 MLST 데이터베이스에 추가되었다.2008년 5월 1일 현재 Campylobacter MLST 데이터베이스에는 Campylobacter(http://pubmlst.org/campylobacter/))에 대한 연구에서 MLST를 사용하거나 언급하는 3516개의 분리물과 약 30개의 간행물이 포함되어 있습니다.

니세리아메닝기디스

MLST는 인간 집단 내의 박테리아와 인간, 식물 및 동물에게 병원성이 있을 수 있는 변종에 대한 보다 풍부한 질감의 그림을 제공했다.MLST 기법은 Maiden 외 (1)에 의해 6개의 로키를 사용하여 Neisseria meningitidis의 특성을 나타내기 위해 처음 사용되었다.MLST의 적용은 전 세계적으로 침습성 질병의 원인으로 알려진 주요 뇌수막구균 계통을 명확하게 해결했다.주요 침습 혈통 사이의 차별적 힘의 수준을 개선하기 위해, 7개의 로키가 현재 사용되고 있으며 많은 연구소에서 뇌수막구균 분리체를 특징짓기 위한 선택 방법으로 받아들여지고 있다.뇌수막염에서 흔히 재조합 교류가 일어나 뇌수막구균 클론의 급속한 다양화를 이끈다는 것은 잘 알려진[7] 사실이다.MLST는 클론 다양화 속도가 일반적으로 낮은 다른 세균 종에서 클론의 특성화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 성공적으로 제공했다.

황색포도상구균

황색포도상구균은 많은 질병을 일으킨다.메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)은 반코마이신을 제외한 거의 모든 항생제에 대한 내성에 대한 우려가 커지고 있다.그러나 지역사회의 심각한 황색포도상구균 감염은 대부분 메티실린 수용성 격리제(MSSA)에 의해 발생하며 심각한 질병과 관련된 고바이러스성 MSSA 클론을 식별하려는 시도는 거의 없었다.따라서 MLST는 MRSA 클론을 특징짓는 명확한 방법을 제공하고 심각한 질병과 관련된 MSSA 클론의 식별을 위해 개발되었다.

스트렙토코커스피오제네스

S. 화농은 인두염에서 괴사성 근막염을 포함한 생명을 위협하는 염증까지 다양한 질병을 일으킨다.S. pyogenes에 대한 MLST 방식이 개발되었습니다.현재 데이터베이스(mlst.net)[8]는 생물체의 전 세계적인 다양성을 나타내는 격리체와 심각한 침습성 [9]질병으로부터 격리된 격리체의 대립 유전자 프로파일을 포함하고 있다.

칸디다 알비칸스

C. 알비칸은 인간의 곰팡이 병원균으로 병원 감염에 책임이 있다.MLST 기술은 C. albicans 분리주 특성을 나타내기 위해 사용되어 왔다.다른 위치에 있는 대립 유전자의 조합은 균주를 구별하는 데 사용될 수 있는 고유한 이배체 배열 유형을 생성합니다.MLST는 병원 내 C. 알비칸의 역학 및 인간과 동물 숙주를 포함한 다양한 생태적 틈새에서 얻은 C. 알비칸의 다양성 연구에 성공적으로 적용되었다.

크로노박터

크로노박터속은 7종으로 이루어져 있다.2007년 이전에는 엔테로박터 사카자키라는 단일 종이 이들 생물에 적용되었다.크로노박터 MLST는 16S rDNA 배열이 항상 충분히 정확하지 않고 생체형이 너무 [10]주관적이기 때문에 처음에 C. sakazakii와 C. malonaticus를 구별하기 위해 적용되었다.크로노박터 MLST 체계는 계통유전분석(MLSA)과 비교게노믹스에 [11]3036bp의 연결배열을 제공하는 ATPD, fusA, glnS, gltB, gyrB, infB 및 ppsA의 7가지 대립유전자를 사용한다.MLST는 또한 새로운 크로노박터 [12]종의 공식 인정에도 사용되어 왔다.이 방법은 하나의 유전자 계통인 시퀀스 타입 4(ST4)와 신생아 뇌수막염 환자 사이의 강한 연관성을 밝혀냈다.[13]Cronobacter MLST 사이트는 http://www.pubMLST.org/cronobacter에 있습니다.

제한 사항

MLST는 집단 유전자 연구에서 가장 잘 나타나지만 비용이 많이 든다.하우스키핑 유전자의 배열 보존으로 인해, MLST는 때때로 박테리아 변종을 분화할 수 있는 식별력이 부족하여 역학 조사에서의 사용이 제한된다.MLST의 식별력을 향상시키기 위해 리스테리아 모노사이토겐을 이용한 MVLST(Multi-Virance-Locus Sequence Type)[14] 접근법이 개발되었으며, MVLST는 MLST의 장점을 넓히지만 하우스키핑 유전자보다 다형성 유전자를 대상으로 한다.인구유전학만이 전염병과 관련된 요소는 아니다.독성 인자는 또한 질병을 일으키는 데 중요하며, 인구 유전 연구는 이것들을 모니터링하는 데 어려움을 겪는다.이것은 관련된 유전자들이 종종 집단 유전자 체계에 비해 변형과 이동성이 높기 때문이다.따라서 예를 들어 대장균의 경우 독소 유전자를 가진 균주를 식별하는 것이 널리 퍼진 균주에 대한 집단 유전학적 평가를 하는 것보다 더 중요하다.

2세대 염기서열 분석 기술의 등장으로 비교적 적은 비용과 노력으로 세균 게놈 전체의 염기서열 정보를 얻을 수 있게 되었고, MLST는 [15]MLST가 처음 개발되었을 때처럼 각 궤적을 개별적으로 배열하는 것이 아니라 전체 유전자 염기서열 정보에서 할당될 수 있게 되었다.전체 게놈 배열은 박테리아 균주를 구별하기 위한 더 풍부한 정보를 제공합니다(MLST는 나머지 세균 게놈은 무시한 채 게놈 배열의 약 0.1%를 사용하여 유형을 지정합니다).예를 들어, 수많은 소이의whole-genome 순서 ST258 클렙시 엘라 속의 pneumoniae 2의 뚜렷한 유전적 clades,[16], ST258에 대해 단일 클론의 원산지를 이전의 가설 수수께끼 이multi-drug 저항력이 모든 생명체의 진화 과정과 확산에 대한 추가 정보를 제공하는으로 구성되는 단일 MLST 혈통을 드러냈다.[17]

데이터베이스

MLST 데이터베이스는 각 유기체에 대한 기준 대립 유전자 배열과 배열 유형을 포함하며, 역학 데이터도 격리한다.웹사이트에는 사용자가 대립 유전자의 배열과 배열 유형을 조회할 수 있는 질문 및 분석 소프트웨어가 포함되어 있습니다.MLST는 연구원 및 공공 의료 종사자를 위한 도구로 널리 사용됩니다.

대부분의 MLST 데이터베이스는 현재 Oxford University(pubmlst.org)에 있는 웹 서버에서 호스팅됩니다.

현장에서 호스트되는 데이터베이스는 유기체 고유의 기준 대립 유전자 염기서열과 개별 유기체에 대한 ST 목록을 보유하고 있습니다.

사용된 시퀀스의 수집 및 포맷을 지원하기 위해 Firefox용 간단하고 무료 플러그인이 개발되었습니다(link Archived 2014-02-22 at the Wayback Machine).

레퍼런스

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  2. ^ Sarris, PF; Trantas, EA; Mpalantinaki, E; Ververidis, F; Goumas, DE (2012). "Pseudomonas viridiflava, a multi host plant pathogen with significant genetic variation at the molecular level". PLOS ONE. 7 (4): e36090. Bibcode:2012PLoSO...736090S. doi:10.1371/journal.pone.0036090. PMC 3338640. PMID 22558343.
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외부 링크

저널 기사