비퇴행성 2광자 흡수

비퇴행성 2광자 흡수(ND-TPA 또는 ND-2PA) 또는 2색 2광자 들뜸은^[2] 에너지가 다른 2광자 흡수(TPA)의 일종으로 분자에 의해 동시에 흡수되어 낮은 에너지 상태에서 높은 에너지 상태로의 분자 전자 전이를 촉진한다.두 광자의 에너지 합계는 전이의 총 에너지와 같거나 더 큽니다.

ND-TPA의 확률은 비퇴행성 2광자 흡수 단면(ND-TPACS)으로 정량화되어 분자의 고유 특성입니다.ND-TPACS는 흡수에 의한 레이저 강도 저하를 측정하는 Z-scan(펌프 프로브) ^[3]기술과 ND-TPA에서 형광체에 의해 발생하는 형광을 측정하는 형광 기반 ^[4]기술을 사용하여 측정되었습니다.

ND-TPA는 제1광자를 흡수함으로써 분자가 가상상태로 이행하고 극히 짧은 시간(가상상태 수명, VSL) 동안 가상상태로 유지된다.VSL 중에 두 번째 광자가 흡수되면 분자는 들뜬 전자 상태로 전환되고, 그렇지 않으면 다시 지면 상태로 이완됩니다.따라서 두 광자는 2광자 흡수에 "거의" 동시에 흡수된다.시간-에너지 불확실성 관계에 기초하여 VSL은 가상 상태와 가장 가까운 실제 전자 상태(즉, 지면 또는 인근 들뜸 상태) 사이의 에너지 차이에 반비례한다.따라서 가상 상태가 실제 상태에 가까울수록 VSL이 길어지고 TPA의 확률이 높아집니다.즉, 가상 상태가 지면 중앙에 있고 들뜬 상태에 있는 퇴화 TPA에 비해 ND-TPA는 흡수 단면이 커집니다.이 현상은 공진강화라고 알려져 있으며 퇴화 TPA 단면에 비해 반도체와 형광구의^[6][7] ND-TPACS가 증가하게 된 주요 메커니즘이다.

ND-TPA는 또한 초점 외 들뜸을 감소시키고 침투 깊이를 증가시키며 공간 분해능을 증가시키고 들뜸 파장 범위를 확장하기 위해 2광자 현미경으로 조사되었다.

이론.

ND-TPA에서 사용하기 위한 중요한 매개변수를 정량적으로 얻기 위한 기술에 대한 다음 설명은 양(Yang) 등에서 논의된 개념의 요약이다.^[8]

맥주의 법칙은 단광자 흡수에 의한 강도 저하를 나타냅니다.

${\displaystyle I(z)=I_{0}e^{-\alpha \,z},}$

$여기$서$$z {$displaystyle$ z$}$는 샘플 내에서 광자가 이동한 거리이고 $)$ {$displaystyle$ I$(z)}$는 샘플에서 $거리{\displaystyle }$z {$displaystyle$z}를 이동한 후의 광강도이고$$α(\$displaystyle \alpha}$는 샘플의 1광자 흡수 계수입니다.

ND-TPA에서는 두 가지 다른 색상의 광자가 결합되어 이전 방정식의 다음과 같은 적응을 제공하며 해석이 용이하도록 근적외선(NIR)과 단파장적외선(SWIR) 광자를 사용합니다.

${\displaystyle I(z)=AI_{NIR}(0)I_{SWIR}(0) e^{-z(\alpha _{NIR}+\alpha _{SWIR}},}$

$여기$서$$\$displaystyle$A는$$ 흡수 단면, 채집 효율, 형광체 농도 및 양자 효율을 나타내는 합성어이다.

ND-TPA에 존재하는 것과 같이 균일하지 않은 플럭스를 가진 형광의 경우, 다음 방정식이 적합하다.

${\displaystyle F=K\int\int\int I_{NIR}(t,r,z)I_{SWIR}(t-t_{0},r-r_{0},z)dVdt,}$

$여기$서 K$(\displaystyle$ K$)$는 형광체의 양자 수율, 영상 시스템의 형상, 형광체 농도의 곱이며 들뜸 상태와 무관하다고 가정하고$\delta {\displaystyle }$(\$displaystyle \sigma)$는 흡수 단면이다.I ${\displaystyle S_{}}$ ${\displaystyle W_{}}$ ${\displaystyle I_{}}$R(\$displaystyle$ I_{SWIR$\})$의 시간과 공간 지연에 나타나듯이 2개의 레이저 펄스의 비동기 레벨은 시료 내 특정 볼륨의 전체 형광에 영향을 미칩니다.또한 광자 빔 플럭스는 이러한 방식으로 결합될 수 있으며, 생물학적 조직과 같이 산란 효과로 인해 다른 광자가 경험하는 플럭스의 감소에 비례하여 한 광자 플럭스가 증가할 수 있다.

ND-TPA의 이점

시료에 서로 다른 에너지 광자를 거의 동시에 주입하면 동일한 에너지가 두 광자 들뜸을 감소시키는 기존 방법보다 유리하다.이러한 장점은 향상된 VSL로 설명할 수 있으며 따라서 흡수 단면이 커집니다.

밝은 형광

VSL이 길기 때문에 퇴화된 2광자 들뜸에 비해 제2광자에 의해 전자가 들뜸 싱글렛 상태로 촉진될 가능성이 높다.가상 상태에서 레일리 또는 라만 산란이 증가하는 대신, 주어진 들뜸 평면에서 더 많은 전자가 들뜸 상태로 촉진되고, 그 후 지면 상태로 방출 속도가 더 높아집니다.이렇게 많은 양의 방출 이벤트는 주어진 지점에서 샘플의 형광 강도가 높아져 신호 대 잡음비가 증가하고 초점이 맞지 않는 ^[9]들뜸의 효과가 감소합니다.

침투 깊이

같은 에너지 2광자 들뜸 현미경법이 공초점 현미경법보다 투과 깊이가 더 뛰어나지만 생체조직의 ^[8]이동평균 자유경로인 1mm 깊이로 제한된다.ND-TPA는 VSL, 흡수단면 및 형광강도가 증가하여 퇴화 2광자 현미경법보다 투과깊이가 커 시료 깊숙이 형광방사가 가능하다.샘플의 모든 깊이 위치에서 ND-TPA는 기존의 2광자 흡수보다 밝은 형광을 제공하며, 따라서 기존의 2광자 현미경 검사로는 불가능한 깊이에서 가시화된 형광을 가능하게 한다.높은 에너지 광자의 높은 산란성 및 빔 플럭스의 다중 ^[8]결합 능력으로 인해 빔 플럭스는 단순히 저에너지 광자가 더 높은 형광률로 관리되도록 조정될 수 있으며, 따라서 샘플 내의 더 큰 깊이에서 고에너지 광자의 손실을 설명할 수 있다.

긴 여자 파장 범위

서로 다른 파장의 두 광자의 조합은 더 큰 흡수 단면을 가능하게 하며, 따라서 퇴화 2광자 현미경법보다 더 넓은 들뜸 범위를 수용할 수 있다.기존의 퇴화 2광자 현미경은 두 배가 되면 지면과 들뜬 전자 상태 사이의 에너지 차이를 설명하는 에너지를 가진 광자에 국한되지만, 생물학적 조직에서는 침투 깊이의 향상과 열화로 인해 퇴화 2광자 들뜸을 근적외선 파장 광학 창에 제한한다.에너지 요건두 번째 광자가 가상 상태와 들뜬 싱글릿 ^[10]상태 사이의 나머지 에너지 차이를 설명하는 한, ND-TPA를 사용하면 사실상 모든 파장을 사용할 수 있다.이 결합된 2광자 들뜸은 266nm ^[8]및 1013nm의 동등한 1광자 들뜸 파장이 필요한 형광체에 대해 입증되었습니다.

공간 분해능 향상

ND-TPA는 현미경 검사 설정에서 퇴화된 2광자 흡수와 결합하면 더 나은 공간 분해능과 축 단면을 제공할 수 있습니다.레이저 빔이 ND-TPA에서 거의 동기화되어야 하기 때문에, 비동기 이벤트가 전체 형광체를 "끄는" 반면, 퇴행성 형광체는 "켜진"^[12] 상태를 유지할 수 있습니다.이것은 유전자나 하위 세포 성분과 같은 특정 구조의 위치를 정확히 파악하기 위해 퇴화 및 비퇴화 2광자 현미경 이미지를 오버레이할 수 있게 한다.음영 링 필터 또는 빔 쉐이핑 기법과 같은 추가 광학 또는 재구성 추가 기능을 사용하면 분해능 ^[13]최적화가 더욱 가능합니다.

비퇴행성 2광자 현미경 개발

비퇴화 2개의 광자 들뜸 현미경을 구현하려면 서로 다른 에너지의 2개의 광자 펄스가 거의 동시에 샘플 평면에서 표본과 상호작용하도록 동기화되어야 한다.흡수단면 및 VSL이 강화되어 여자시간이 길어지기 때문에 완벽한 동기화가 불필요하다.단, 펄스의 근접 동기화는 10ns 이내로 하는 것이 좋습니다.이것과 다른 물류상의 이유로, 1개의 Ti:사파이어 펨토초 레이저를 사용하여 단일 레이저 펄스열을 만듭니다.레이저광은 반파판을 통과해 편광면을 회전시킨 후 편광빔 스플리터를 통과해 2개의 빔으로 분리된다.1개의 빔이 광학 파라미터 발진기(OPO)에 통과하고, 이 OPO는 들어오는 고주파 빔을 저주파 성분으로 분할하여 결과적으로 발생하는 빔은 들어오는 빔보다 파장이 길고 에너지가 낮습니다.이 빔도 자동 디포커저를 통과합니다.두 번째 빔은 지연선을 통해 리다이렉트되며, 미러는 OPO의 낮은 에너지 출력과 높은 에너지 레이저 펄스를 거의 완벽하게 동기화하도록 최적화됩니다.두 빔은 다시 반파판을 통과하고 나서 미리 선택된 저파장 레이저 빔이 통과할 수 있는 다이크로익 미러에서 만나면서 고파장 빔이 직교로 반사되어 저파장 빔과 만나 혼합된다.두 개의 다른 파장 빔으로 구성된 이 혼합 빔은 다른 이색 미러를 통과한 후 물체에 의해 시료에 초점이 맞춰집니다.결과적으로 발생하는 일관성이 없는 형광은 부분적으로 대상을 통해 방향 변경되고 두 번째 이색 거울에서 다른 이색 거울로 반사된다. 이 이 이 이색 거울은 광전자 증배관(PMT)으로 통과하기 전에 다시 빔을 밴드 패스 필터로 반사시킨다.그런 다음 이 신호가 이미징됩니다.

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