해상도

RESOLFT는 REVERSABLE Saturable OpticaL Fluorescence Transitions의 약자로 매우 높은 분해능을 가진 광학 형광 현미경 기술 그룹을 나타냅니다.표준 원거리 가시광선 광학을 사용하면 분자 눈금까지 회절 한계보다 훨씬 낮은 분해능을 얻을 수 있습니다.

기존의 현미경 검사 기술에서는 사용되는 파장의 약 절반(가시광선의 경우 약 200 nm) 미만의 거리에 위치한 특징을 구별할 수 없다.이 회절 한계는 빛의 파동에 기초한다.기존 현미경에서 한계는 사용된 파장과 광학계의 수치 개구부에 의해 결정된다.RESOLFT 개념은 분자를 일시적으로 조명 시 (형광-) 신호를 전송할 수 없는 상태로 전환함으로써 이 한계를 극복합니다.이 개념은 사용되는 파장이 훨씬 작은 전자 현미경 검사와 다릅니다.

작동 원리

RESOLFT 현미경은 기존의 현미경이나 공초점 현미경으로는 촬영할 수 없는 샘플의 디테일을 촬영할 수 있는 매우 고해상도의 광학 현미경입니다.RESOLFT 내에서 STED 현미경^[1][2] 검사와 GSD 현미경의 원리를 일반화합니다.일반적으로 서로 너무 가까워서 구별할 수 없는 구조물은 순차적으로 읽힙니다.

이 프레임워크 내에서 모든 방법은 적어도 두 개의 구별 가능한 상태를 가지고 있고, 두 상태 사이의 가역 전환이 가능하며, 그러한 전환이 광학적으로 유도될 수 있는 분자에 대해 작동한다는 것을 설명할 수 있다.

대부분의 경우 형광마커를 사용하여 밝은 상태(A)는 형광신호를 발생시키고 다른 상태(B)는 어두운 상태로 신호를 주지 않는다.이들 사이의 한 가지 전환은 빛에 의해 유도될 수 있다(예: A→B, 밝은 것부터 어두운 것).

샘플은 매우 작은 위치(이상 조건에서는 0)의 조명 강도로 균일하지 않게 조명됩니다.여기서만 분자는 어두운 상태 B가 아니며(A가 기존 상태일 경우) 완전히 밝은 상태 A로 유지됩니다.분자가 대부분 밝은 상태에 있는 영역은 전이광 강도를 높임으로써 매우 작게(기존 회절 한계보다 작게) 만들 수 있습니다(아래 참조).따라서 검출된 신호는 최소 조도 주변의 작은 영역의 분자에서만 발생하는 것으로 알려져 있습니다.시료를 주사함으로써,^[3] 즉 표면을 가로질러 조명 프로파일을 이동시킴으로써 고해상도 이미지를 구성할 수 있습니다.

B에서 A로의 복귀는 자발적이거나 다른 파장의 빛에 의해 추진될 수 있습니다.샘플을 스캔하는 동안 서로 다른 시간에 상태 A 또는 B에 존재하려면 분자를 여러 번 전환할 수 있어야 합니다.이 방법은 또한 밝기와 어두운 상태가 반전되어 음의 이미지를 얻는 경우에도 작동합니다.

분해능 회절 한계 미만

RESOLFT에서는 분자가 A상태(밝은 상태)에 있는 면적을 회절 한계에도 불구하고 임의로 작게 만들 수 있다.

• 시료를 균일하지 않게 조명해야 격리된 영점 강도점이 생성된다.이는 예를 들어 간섭에 의해 달성될 수 있습니다.
• 낮은 강도(이미지의 파란색 선보다 낮음)에서 대부분의 마커 분자는 밝은 상태이며, 명암을 초과하는 경우 대부분의 마커 분자는 어두운 상태입니다.

약한 조명에서는 대부분의 분자가 상태 A에 있을 정도로 조도가 낮기 때문에 분자가 상태 A에 남아 있는 영역이 여전히 매우 크다는 것을 알 수 있습니다.조명 프로필의 모양은 변경할 필요가 없습니다.조명의 밝기를 높이면, 이미 명도가 어두운 상태로 효율적으로 전환하기 위한 양보다 작은 영역이 됩니다.따라서 A상태에서 분자가 존재할 수 있는 면적도 작아진다.다음 판독 시 (형광) 신호는 매우 작은 지점에서 발생하며 매우 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.

RESOLFT 개념에서는 해상도는 ${\displaystyle \delta }$ d ${\displaystyle \simeq }$ ${\displaystyle \frac{n}{}}$ ${\displaystyle \frac{\sqrt{\frac{I}{}}}{}}$ ${\displaystyle \frac{\sqrt{\frac{s}{}}}{}}$ a ${\displaystyle \frac{\sqrt{\frac{t}{}}}{}}$\ $display$style \ $Delta$d \ $simeq${ \ $pi n$ { \ $sqrt${ \$frac$ { $I }$ { ${\displaystyle {\mathrm{Isat}}_{}}$ $}$ $$}$,$ ,$stylestylestylestylestylestyle stylestylestylestylestyle$ in in in i i i in in in \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \te A 및 절반 상태 B) 및 $(\displaystyle$ I$)$는 적용된 강도를 나타냅니다.숫자 ${\displaystyle \text{개구부}}$ NA ${\displaystyle =}$ ${\displaystyle n}$ sin${\displaystyle \mathrm{\alpha \alpha }}$ ${$ $displaystyle${ $mbox$}의 광학에 초점을 맞추어 최소값을 산출하는 경우$NA}}=n\sin \alpha$ 2개의 동일한 물체를 식별할 수 있는 최소 거리는 ${\displaystyle \mathrm{\delta d}}$ ${\displaystyle =}$ ${\displaystyle \frac{\mathrm{\delta 2}}{}}$ n$$ sin$$δα${\displaystyle \frac{\delta \sqrt{\mathrm{}}}{}}$ 1${\displaystyle \frac{\sqrt{}}{}}$+ ${\displaystyle \frac{\sqrt{I\frac{}{}}}{}}$ ${\displaystyle \frac{\sqrt{\frac{\mathrm{as}}{}}}{}}$ ${\displaystyle \frac{\sqrt{\frac{a}{}}}{}}$t \ $displaystyle \Delta$ d =$$δ frac { $2 n$\ cdot \alpha$}$ { cda \$cda$ \$cda$ \$cda$ { cda } { cda { cda } { cd { $cda$ } { cd { cd { cd { $cd$ { cd { cd { cda } }The diffraction-unlimited nature of the RESOLFT family of concepts is reflected by the fact that the minimal resolvable distance ${\displaystyle \Delta d}$ can be continuously decreased by increasing ${\displaystyle \varsigma ={\frac {I}{Isat}}}$. Hence the quest for nanoscale resolution comes down to maximizing이 수량이는 I$\style$I_$${$sat$을$($를) 늘리거나 $\$sat}을(를) 낮추면 가능합니다.

변종

분자 상태를 전환할 때 다른 과정이 사용됩니다.단, 적어도 2개의 구별 가능한 상태가 사용된다는 공통점을 가지고 있습니다.일반적으로 사용되는 형광 특성은 상태의 구별을 표시하지만 흡수 또는 산란 특성도 ^[4]이용할 수 있기 때문에 이는 필수적이지 않다.

STED 현미경 검사

(주요 기사 STED 현미경 검사)

STED 현미경법(Stimulated Emission Depletion 현미경법)^[1][2]에서는 형광광자를 송출하면서 형광염료 분자를 전자 접지 상태와 들뜬 상태 사이에서 구동한다.이것은 형광 현미경 검사에서 표준 작동 모드이며 상태 A를 나타냅니다.B상태에서는 자극방출에 의해 염료가 전자접지상태로 영속적으로 유지된다.염료가 상태 B가 아닌 상태 A에서 형광을 발생시킬 수 있는 경우 RESOLFT 개념이 적용됩니다.

GSD 현미경 검사

(주요 기사 GSD 현미경 검사)

GSD 현미경 검사(Ground State Depletion 현미경 검사)도 형광 마커를 사용합니다.상태 A에서는 지면과 제1의 들뜬 상태 사이에서 분자를 자유롭게 구동할 수 있어 형광을 송출할 수 있다.어두운 상태 B에서는, 분자의 바닥 상태가 과소화되어, 형광이 방출되지 않는 장수 들뜸 상태로 이행한다.분자가 어두운 상태에 있는 한 지면과 들뜬 상태 사이를 순환할 수 없기 때문에 형광은 꺼집니다.

SPEM 및 SSIM

SPEM(포화 패턴 들뜸 현미경)^[5]과 SSIM(포화 구조 조명 현미경)^[6]은 포화 들뜸을 사용하여 "음성" 이미지를 생성하기 위해 RESOLFT 개념을 활용하고 있습니다. 즉, 현미경의 기하학적 초점 주변의 매우 작은 영역을 제외한 모든 곳에서 형광이 발생합니다.또, 조명에는 점상 패턴 이외의 것을 이용한다.긍정적인 영상을 다시 얻으려면 수학적 영상 재구성이 필요합니다.

전환성 단백질에 의한 RESOLFT

일부 형광 단백질은 적절한 파장의 빛에 의해 켜지거나 꺼질 수 있다.RESOLFT형 ^[7]현미경에 사용할 수 있습니다.빛을 비추는 동안, 이 단백질들은 그들의 구조를 변화시킨다.그 과정에서 그들은 형광을 방출하는 능력을 얻거나 잃는다.형광 상태는 상태 A에 대응하고, 비 형광 상태는 상태 B에 대응하며, RESOLFT 개념은 다시 적용됩니다.가역적 전환(예: B에서 A로 되돌아가기)은 자발적으로 또는 빛에 의해 다시 구동된다.단백질의 구조 변화를 유도하는 것은 자극 방출 또는 기저 상태 고갈(일부 W/cm²)에 비해 훨씬 낮은 스위칭 광강도로 이미 달성될 수 있다.등방성 분해능이 40nm 미만인 4Pi 현미경 영상과 함께 저조도 수준의 ^[8]살아있는 세포를 촬영했습니다.

전환 가능한 유기 염료에 의한 RESOLFT

단백질과 마찬가지로 일부 유기 염료도 조명 ^[9][10]시 구조를 바꿀 수 있습니다.이러한 유기 염료의 형광은 가시광선을 통해 켜고 끌 수 있습니다.다시 한번 적용된 광강도는 상당히 낮을 수 있습니다(약 100W/cm²).

레퍼런스