STED 현미경 검사

자극 방출 감소(STED) 현미경은 초해상도 현미경을 구성하는 기술 중 하나이다.형광체의 선택적 비활성화를 통해 초해상도 이미지를 생성하여 초점에서의 조명 영역을 최소화하여 주어진 시스템에 ^[1]대해 달성 가능한 해상도를 높입니다.그것은 Stefan W에 의해 개발되었다. Hell과 Jan Wichmann은 ^[2]1994년에 Hell과 Thomas Klar에 의해 실험적으로 처음 증명되었다.^[3]헬은 그 개발로 2014년 노벨 화학상을 받았다.1986년에 V.A.오호닌^[4](소련 ^[5]생물물리학 연구소, 시베리아 지부, 크라스노야르스크)은 STED 아이디어를 특허로 취득했다.이 특허는 1994년에 Hell과 Wichmann에게 알려지지 않았다.

STED 현미경은 분해능을 높이기 위해 광현미경의 회절 한계를 우회하기 위해 최근에 개발된 여러 종류의 초고해상도 현미경 기술 중 하나이다.STED는 분해능을 향상시키기 위해 생물학적 샘플에 라벨을 붙이는 데 일반적으로 사용되는 형광체의 비선형 응답을 이용하는 결정론적 기능 기술이다. 즉, STED는 회절 한계 이하의 분해능에서 이미지를 촬영할 수 있도록 한다.이러한 방법들은 수학 모델을 사용하여 많은 회절 제한 영상의 하위 회절 한계를 재구성하기 때문에 이것은 광활성화 국소 현미경(PALM) 및 확률 광학 재구성 현미경(STORM)과 같은 확률적 기능 기법과 다르다.

배경

전통적인 현미경 검사에서 얻을 수 있는 분해능은 빛의 회절에 의해 제한되었다.에른스트 아베는 이 한계를 설명하는 방정식을 개발했습니다.계산식은 다음과 같습니다.

$\displaystyle \mathrm {D} = frac {2n\sin {alpha } = frac {2}NA} }}}}$

여기서 D는 회절 한계, θ는 빛의 파장, NA는 매체의 굴절률, 즉 입사각의 사인 곱셈이다.n은 시료의 굴절률을 나타내며, α는 물체별로 빛을 모으는 고체 반각도를 나타내며, θ는 시료를 들뜨게 하는 데 사용되는 빛의 파장, NA는 수치 개구부이다.높은 분해능(즉, 작은 d 값)을 얻으려면 짧은 파장과 높은 NA 값(NA = n sinα)이 ^[6]최적입니다.이 회절 한계는 모든 초분해능 방법을 측정하는 기준입니다.STED는 선택적으로 형광을 비활성화하기 때문에 기존의 공초점 현미경 검사보다 분해능을 더 높일 수 있다.정상 형광은 기본 에너지 레벨이 다른 들뜬 전자 상태로 전자를 들뜨게 함으로써 일어난다(S0은 S1로 간다). S0에서 S1에서 진동 에너지 레벨로 떨어짐으로써 광자를 방출한다(S1의 S0). STED는 광자가 방출되기 전에 이 처리를 중단한다.d. 들뜬 전자는 형광 천이가 들어가는 것보다 더 높은 진동 상태로 이완되어 광자가 오른쪽에 ^[7]있는 그림과 같이 적색 시프트로 방출된다.전자가 더 높은 진동 상태가 되기 때문에 두 상태의 에너지 차이는 일반적인 형광 차이보다 낮습니다.이 에너지의 저하는 파장을 증가시키고 광자가 스펙트럼의 빨간색 끝으로 더 멀리 이동하도록 합니다.이 변화는 두 종류의 광자를 구별하고 자극된 광자를 무시할 수 있게 한다.

이 대체 방출을 강제로 발생시키려면 입사 광자가 형광체에 부딪혀야 합니다.입사 광자에 의해 타격되어야 하는 것은 STED에 두 가지 영향을 미친다.첫째, 입사 광자의 수가 이 방출의 효율에 직접 영향을 미치고 둘째, 충분히 많은 광자 형광을 완전히 ^[8]억제할 수 있다.형광을 억제하는 데 필요한 많은 입사 광자를 얻으려면 광자를 생성하는 데 사용되는 레이저가 고강도여야 한다.불행히도 이 고강도 레이저로 인해 형광체 광표백 문제가 발생할 수 있습니다.광표백은 형광체가 고강도 빛에 의해 파괴되는 것을 말합니다.

과정

STED는 검체의 특정 영역에서 형광을 감소시키고 중앙 초점은 형광을 방출하기 위해 활성 상태로 둡니다.이 초점 영역은 대물 ^[9][10][11]렌즈의 동공 평면의 특성을 변경하여 설계할 수 있습니다.이러한 회절광학소자(DOE)의 가장 일반적인 초기 예는 아래와 같은 2차원 측면 구속에 사용되는 토러스 형태이다.적색 구역은 고갈되고 녹색 스팟은 활성 상태로 유지됩니다.이 DOE는 광학 소용돌이와 결합된 고갈 레이저의 원형 편광에 의해 생성됩니다.이 DOE의 측면 분해능은 일반적으로 30 - 80 nm이다.다만, 2.4 nm 이하의 값이 ^[12]보고되고 있습니다.다른 DOE를 사용하여 약 100nm의 축 분해능이 ^[13]입증되었습니다.수정된 아베 방정식은 이 하위 회절 분해능을 다음과 같이 설명합니다.

${\displaystyle \mathrm {D} = frac {2n\sin {alpha} {\frc rt {1+{\frac {I}} {I_{\text{sat}}}}}}}}}}=sq{\mathrm {2}NA}({sqrt {1+\sigma}}})$

$여기$서 n$(\$textstyle $n)$은 매체의 굴절률,$I$(\$textstyle$ I$)$는 체강 내 강도, $(\$는 포화 강도입니다.$여기$서 ${\$ { $textstyle$\$sat }$는 적용된 (최대) STED 강도와 포화 강도의 비율을 나타내는 포화 계수입니다. ${}_{}$ $=$ ${\text{I}}_{}$max / I $sat$I _ { \ $text { max$} / $I$ _ { \$text$ { $sat$}$$^[6][14]。

STED의 효과를 최적화하려면 초점 중심에서의 파괴적 간섭이 가능한 한 완벽에 가까워야 합니다.그것은 사용할 수 있는 광학에 일정한 제약을 가한다.

염료

STED의 개발 초기에, 그 과정에서 사용될 수 있는 염료의 수는 매우 제한적이었다.로다민 B는 STED의 ^[2]첫 번째 이론적 설명에서 명명되었다.그 결과, 최초로 사용된 염료는 적색 스펙트럼에서 레이저를 방출하는 것이었다.생물학적 시스템의 STED 분석을 위해 염료와 레이저 소스를 시스템에 맞게 조정해야 합니다.이러한 시스템의 더 나은 분석에 대한 이러한 욕구는 살아있는 세포 STED와 다색 STED로 이어졌지만,^[7] 또한 향상된 기능을 수용하기 위해 점점 더 발전된 염료와 들뜸 시스템을 요구해왔다.

그러한 진보 중 하나는 면역라벨 세포의 발달이었다.이 세포들은 아미드 결합을 통해 항체에 결합된 STED 형광 염료이다.이 기술의 첫 번째 사용은 빨간색 염료인 MR-121SE와 2차 항쥐 ^[8]항체를 결합시켰다.첫 번째 적용 이후, 이 기술은 녹색 방출, Ato ^[15][16][17]532 및 황색 방출, Ato ^[18]590 및 추가 적색 방출 염료 등 훨씬 광범위한 염료에 적용되었습니다.또한 Ato 647N은 2색 STED를 ^[19]제작하기 위해 처음 사용되었습니다.

적용들

지난 몇 년 동안 STED는 복잡하고 매우 특이적인 기술에서 일반적인 형광 방법으로 발전해 왔다.그 결과, STED의 효용을 확장하고 더 많은 정보를 제공할 수 있는 많은 방법이 개발되었습니다.

구조 분석

STED는 공정 초기부터 전자현미경을 통해서만 가능했던 작업을 형광현미경으로 수행할 수 있도록 했다.예를 들어, STED는 하위 기관 수준의 단백질 구조 분석의 설명에 사용되었다.이 수준의 연구에 대한 일반적인 증거는 세포골격 필라멘트의 관찰이다.또한 STED와 공초점 현미경의 ^[20][21][22]분해력을 비교하기 위해 신경 필라멘트, 액틴 및 튜뷸린이 자주 사용됩니다.

STED를 사용하여 막융합을 조절하는 인간 단백질인 SNAP25를 검사하는 동안 70~90nm의 가로 분해능을 달성했습니다.이를 통해 SNAP25는 SNARE 모티브의 기능과 독립적으로 클러스터를 형성하고 클러스터된 ^[23][24]구문과 바인딩된다는 것을 알 수 있습니다.미토콘드리아와 같은 복잡한 소기관들에 대한 연구도 구조 분석을 위한 STED 현미경 검사로부터 이익을 얻는다.가로 해상도가 50nm 미만인 맞춤형 STED 현미경을 사용하여 미토콘드리아 단백질 Tom20, VDAC1, COX2가 나노스케일 ^[25][26]클러스터로 분포하는 것으로 밝혀졌다.또 다른 연구는 집에서 만든 STED 현미경과 DNA 결합 형광 염료를 사용했는데, 이것은 공초점 ^[27]현미경으로 기존의 측정치보다 훨씬 더 정밀하게 DNA 조각의 길이를 측정했다.

상관법

STED 현미경은 그 기능 때문에 다른 고해상도 방법과 함께 사용할 수 있습니다.시마 등은 STED 분해능보다 전자 및 원자력 현미경 분해능이 뛰어나지만, STED와 원자력을 결합함으로써 세포 ^[28]강성의 변화를 관찰하면서 인간 난소암 세포의 액틴 세포골격을 시각화할 수 있었다.

다색

다색 STED는 단백질의 구조와 기능 사이의 의존성을 연구하기 위해 STED를 사용하는 데 있어 증가하는 문제에 대응하여 개발되었다.이러한 유형의 복잡한 시스템을 연구하려면 적어도 두 개의 개별 형광체를 사용해야 합니다.두 개의 형광 염료와 빔 쌍을 사용하여 5nm 이하의 분해능으로 시냅스 및 미토콘드리아 단백질 클러스터의 혈소화 이미징이 가능하다[18].다색 STED는 또한 시냅스 소포 단백질의 다른 집단이 탈출 시냅스 부톤을 ^[29][30]섞지 않는다는 것을 보여주기 위해 사용되어 왔다.멀티 라이프 타임 촬상 기능이 있는 2색 STED를 사용하면 3채널 STED가 가능하다.

라이브 셀

초기에, STED는 살아있는 ^[13]세포를 다루는 데 유용한 기술로 여겨졌다.불행히도 세포들이 연구되는 유일한 방법은 혈장막에 유기 ^[29]염료를 붙이는 것이었다.STED와 형광 상관 분광법을 조합한 결과 콜레스테롤 매개 분자 복합체가 스핑고지질을 트랩하지만 일시적인 ^[31]것으로 나타났다.하지만 형광 단백질만이 살아있는 세포에 있는 세포나 단백질을 시각화하는 능력을 제공한다.이 방법은 포유동물 세포를 ^[32][33]발현하는 시트린-튜브린 내에서 50 nm 가로 분해능에서 작동하는 것으로 나타났다.STED는 포유동물 세포의 구조를 검출하는 것 외에 식물 ^[34]세포의 혈장막에서 YFP 태그 부착 PIN 단백질 군집을 시각화할 수 있도록 했다.

최근에는 펄스 원적 레이저와 CLIPf 태그 및 SNAPf 태그 발현을 ^[35]사용하여 다색 라이브 셀 STED가 수행되었습니다.

온전한 동물의 뇌에서

마우스 피질의 표피층은 ^[36]두개골 창을 통해 반복적으로 촬영할 수 있다.이것은 몇 ^[37]주 동안 개별 수상돌기의 운명과 모양을 따라갈 수 있게 해줍니다.두 가지 색상의 STED로, 심지어 살아있는 ^[38]동물의 시냅스 후 밀도의 나노 구조를 해결하는 것도 가능하다.

비디오 레이트 이상의 STED

초해상도에는 작은 픽셀이 필요합니다.즉, 주어진 샘플에서 획득할 수 있는 공간이 많아져 수집 시간이 길어집니다.단, 초점 사이즈는 고갈에 사용되는 레이저의 강도에 따라 달라집니다.그 결과, 이 스폿 사이즈를 조정할 수 있어 사이즈나 촬상 속도를 변경할 수 있다.그런 다음 각 특정 이미징 작업에 대해 이러한 두 요소 간에 타협을 이룰 수 있습니다.초당 80프레임의 속도가 기록되었으며, 초점은 약 ^[1][39]60nm입니다.작은 ^[40]시야에서는 초당 최대 200프레임까지 도달할 수 있습니다.

문제

광표백은 더 높은 들뜸 상태에서의 들뜸 또는 트리플렛 상태의 들뜸에서 발생할 수 있다.들뜬 전자의 들뜸을 다른 높은 들뜸 상태로 만드는 것을 방지하기 위해, 대체 방출을 촉발하는 데 필요한 광자의 에너지는 들뜸의 에너지와 한 들뜸 상태에서 다른 ^[41]들뜸 상태로 겹치지 않아야 한다.이렇게 하면 형광체와 접촉하는 각 레이저 광자가 자극 방출을 일으키고 전자가 다른 높은 에너지 상태로 들뜨지 않도록 할 수 있습니다.트리플렛 상태는 싱글렛 상태보다 훨씬 더 오래 지속되며, 트리플렛 상태의 들뜸을 방지하기 위해서는 레이저 펄스 사이의 시간이 충분히 길어야 하며, 다른 퀀칭 방법을 통해 전자가 이완될 수 있도록 하거나, 트리플렛 ^[20][42][43]상태를 완화하기 위해 화합물을 첨가해야 한다.

「 」를 참조해 주세요.

• 공초점 현미경 검사
• 형광
• 형광 현미경
• 레이저 주사 공초점 현미경법
• 광학 현미경
• 광활성 국재 현미경법
• 확률적 광학 재구성 현미경법
• 초해상도 현미경법
• 지반 상태 고갈 현미경법

레퍼런스

외부 링크

• 막스플랑크 생물물리화학연구소 나노생물조화학과 개요.
• 스테판 헬이 개발한 RESOLFT 방정식의 간단한 요약.
• Stefan Hell 강의:초해상도:개요 및 자극적 배출량 감소(STED) 현미경 검사
• 라이트 현미경:현재 진행 중인 현대적 혁명(입문 리뷰)