STAR-seq

STARR-seq

STAR-seq(자체 변환 활성 규제 영역 시퀀싱의 줄임말)는 임의의 DNA 출처로부터 수백만 명의 후보자에게 진취제 활동을 분석하는 방법이다.직접적, 정량적, 게놈적 방식으로 전사적 증감기 역할을 하는 염기서열을 식별하는 데 사용된다.[1]

A
STAR-seq 방법론

소개

진핵생물에서 전사는 유전자의 촉진자와 관련된 특정 DNA 결합 단백질(전송 인자)과 진통제를 포함한 원거리 제어 시퀀스에 의해 조절된다.엔핸서(enhancer)는 다양한 전사 인자에 대한 여러 결합 부위가 포함된 비코딩 DNA 시퀀스다.[2]그들은 일반적으로 염색질 구조를 변조하고 유전자의 촉진자에 배치된 전사 기계와 직접 상호작용하는 전사 인자를 모집한다.Enhancer는 대상 유전자의 전사를 유전자의 촉진자로부터의 위치나 거리와는 무관하게 세포 유형별 방식으로 조절할 수 있다.[1]때때로 그들은 다른 염색체에 위치한 유전자의 전사를 조절할 수 있다.[3]그러나 지금까지 엔핸서(enhancer)에 대한 지식은 소수의 엔핸서(enhancer)에 대한 연구로 한정되어 있었는데, 이는 게놈의 규모로는 정확한 식별이 어려웠기 때문이다.[2]더욱이 많은 규제 요소들은 특정 세포 유형과 특정 조건에서만 기능한다.[4]null

엔한서 검출

드로소필라의 엔한서 검출은 최소한의 프로모터의 하류에서 리포터 단백질을 인코딩하는 트랜스포존 유래 벡터의 무작위 삽입을 이용한 독창적인 방법론이다.이 접근방식은 유전자변형동물에서 리포터의 표현을 관찰할 수 있게 하며 이러한 순서에 의해 조절되는 근처 유전자에 대한 정보를 제공한다.세포 유형의 발견과 그 결정에 관여하는 유전자와 함께 세포 유형의 발견과 특성화는 이 기법의 발견으로 현저하게 개선되었다.[5][6][7][8]null

지난 몇 년 동안, 유전자 후 기술은 진해제 발견을 향상시킨 침착하고 활동적인 진해제들의 특정한 특징을 보여주었다.[2]DNase I 과민성 현장의 심층 염기서열 분석(DNase-Seq), 포름알데히드 보조 규제요소 염기서열 분석(FAIRE-Seq), 심층 염기서열 분석(Chip-sequenceing) 등의 새로운 방법을 개발하면 엔핸서 관련 크로마틴 특징에 의한 게놈 전사 예측을 제공한다.[1]null

적용

DHS-시퀀싱 및 FAIRE-시퀀싱은 증진제 활동에 대한 직접적인 기능적 또는 정량적 판독값을 제공하지 못한다.이것을 얻기 위해서는, 리포터 대본의 많은 부분에서 강한 힘을 추론할 필요가 있다고 리포터는 분석한다.더욱이 그러한 분석은 유전체 전반에 걸친 방법으로 엔핸서 식별에 필요한 수백만 가지 테스트를 제공할 수 없다.[1]STARR-seq의 개발은 직접적, 정량적, 게놈적 방식으로 엔핸서를 식별하는 데 도움이 된다.엔핸서들이 상대적 위치와 무관하게 일할 수 있다는 지식을 이용하여, 후보 순서는 최소한의 프로모터의 하류에 배치되어 활동적인 엔핸서들이 자신을 기록할 수 있게 한다.각 증류제의 강도는 세포 RNA들 사이의 풍부함에 의해 반영된다.그러한 후보 시퀀스의 직접적인 결합은 임의 출처에서 나온 수백만 개의 DNA 파편을 병렬로 평가할 수 있게 한다.[1]null

방법론

유전체 DNA는 무작위로 깎여 작은 조각으로 분해된다.어댑터는 크기가 선택된 DNA 조각에 묶인다.다음으로 어댑터 연결 파편이 증폭되고 PCR 제품이 정제된 후 최소 선별 벡터 추진자의 후보 시퀀스를 다운스트림에 배치하여 스스로 기록할 수 있는 기회를 제공한다.그리고 나서 후보 세포들은 리포터 라이브러리와 함께 전염되어 배양된다.그 후, 총 RNA가 추출되고 폴리 A RNA가 분리된다.역전사법을 사용하여 cDNA를 생성, 증폭한 다음 후보 파편을 높은 투과율 페어링 엔드 시퀀싱에 사용한다.시퀀스 리딩은 참조 게놈에 매핑되며 데이터의 연산 처리를 수행한다.[1]null

드로소필라에서 엔한서 발견

이 기술을 드로필라 게놈에 적용하면서 아놀드 외 [1]연구진은 최소 10배 이상의 커버리지를 가진 비반복성 게놈의 96%를 발견했다.저자들은 특히 첫 번째 인트론 및 유전자간 영역에 확인된 대부분의 엔핸서(55.6%)가 인트론 내에 위치한다는 사실을 발견했다.4.5%의 엔핸서가 전사 시작 부위(TSS)에 위치하여, 이들 엔핸서가 전사 작업을 시작할 수 있고 먼 TSS에서 전사 기능을 개선할 수 있음을 시사했다.[1]가장 강력한 엔핸서들은 세포골격의 효소나 성분과 같은 하우스키핑 유전자와 전사 인자와 같은 개발 규제 기관 근처에 있었다.가장 강한 강화제는 전사 계수 zfh1의 인트론 안에 위치했다.이 전사 인자는 드로소필라에서 신경펩타이드의 발현과 애벌레 신경근접합부의 성장을 조절한다.[9]리보솜 단백질 유전자는 엔핸서 순위가 낮은 유일한 유전자 등급이었다.게다가, 저자들은 많은 유전자들이 심지어 하나의 세포 타입에서도 몇몇 독립된 활성증진기들에 의해 조절된다는 것을 증명했다.더욱이, 평균적으로 유전자 발현 수준은 유전자 당 진약 강도의 합과 상관관계가 있어 유전자 발현과 진약 활동 사이의 직접적인 연계를 뒷받침한다.[1]null

인간유전연구 코호트의 규제변형 알레르기의 특성화

이 기술을 규제 변종 알레르기의 특성화와 발견에 적용하여, 보클리 외 연구진은 연구 코호트의 95명의 게놈에서 직접 포착된 100개의 퍼팅 엔핸서들의 활동을 측정하면서 비코딩 규제 요소 기능에 대한 인간 유전적 변동의 영향을 특징으로 삼았다.[10]이 접근방식은 eQTL 분석으로 식별된 높은 연계불균형 지역의 인과 규제 변형의 기능적 정밀도를 가능하게 한다.이 접근방식은 복잡한 표현형식에 기여하는 유전자 규제 요소의 동요를 식별하기 위한 일반적인 경로를 제공한다.null

Chip 농축 DNA 파편의 증진제 활동 수량화

STAR-seq는 특정 전사 요인에 의해 점유된 현장의 DNA 조각의 규제 활동을 측정하는 데 사용되어 왔다.글루코르티코이드 수용체의 염색질 면역복제로 생성된 ChIP DNA 라이브러리를 STAR-seq로 복제하면 글루코르티코이드 유도 증진제 활성의 게놈 스케일 정량화가 가능하다.[11]이 접근방식은 동일한 전사 인자에 의해 구속되는 사이트 간의 강화제 활성도 차이를 측정하는 데 유용하다.null

이점

  • 진통제 검출에 대한 정량적 게놈 검사.[1]
  • 리포터 구조를 적절하게 도입할 수 있는 모든 세포 유형 또는 조직에서 DNA의 임의 출처를 선별하는 데 적용되는 기술.[1]
  • 대본 파괴 요소를 포함하는 시퀀스에도 페어 엔드 시퀀싱을 적용하여 탐지율이 높은 방법(>99%)
  • 진통제 강도를 정량적으로 평가하고 염색체 문맥에 통합하여 내생적으로 침묵된 진통제를 식별하는 기법.[1]

퓨처 디렉션스

STAR-seq는 전통적인 접근법과 고투과 시퀀싱 기술 및 고도로 전문화된 바이오 컴퓨터 방법을 결합하여 엔핸서를 정량적이고 게놈적으로 검출할 수 있다.정상적인 발달 과정과 질병에서도 유전자 조절과 게놈의 책임 있는 경로에 대한 연구는 매우 까다로울 수 있다.따라서 유기체에 걸쳐 많은 세포 유형에 STAR-seq를 적용하면 세포 유형별 유전자 규제 요소를 식별하고 질병을 유발하는 비코딩 돌연변이를 실질적으로 평가할 수 있다.최근, STARR-seq 기법에 대한 관심 영역의 관련 접근 결합 캡처가 포유류 세포 라인에서 개발되고 광범위하게 검증되었다.[12]null

참조

  1. ^ a b c d e f g h i j k l Arnold, Cosmas; Daniel Gerlach; Christoph Stelzer; Łukasz M. Boryń; Martina Rath; Alexander Stark (January 2013). "Genome-Wide Quantitative Enhancer Activity Maps Identified by STARR-seq". Science. 339 (6123): 1074–7. doi:10.1126/science.1232542. PMID 23328393. S2CID 54488955.
  2. ^ a b c Xu, Jian; Stephen T. Smale (November 2012). "Designing an Enhancer Landscape". Cell. 151 (5): 929–931. doi:10.1016/j.cell.2012.11.007. PMC 3732118. PMID 23178114.
  3. ^ Ong, Chin-Tong; Victor G. Corces (April 2011). "Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression". Nature Reviews Genetics. 12 (4): 283–293. doi:10.1038/nrg2957. PMC 3175006. PMID 21358745.
  4. ^ Baker, Monya (28 April 2011). "Highlighting enhancers". Nature Methods. 8 (5): 373. doi:10.1038/nmeth0511-373. PMID 21678620.
  5. ^ Bellen, Hugo J (December 1999). "Ten Years of Enhancer Detection: Lessons from the Fly". The Plant Cell. 11 (12): 2271–2281. doi:10.2307/3870954. JSTOR 3870954. PMC 144146. PMID 10590157.
  6. ^ Bier, E; Vaessin H; Shepherd S; Lee K; McCall K; Barbel S; Ackerman L; Carretto R; Uemura T; Grell E (September 1989). "Searching for pattern and mutation in the Drosophila genome with a P-lacZ vector". Genes & Development. 3 (9): 1273–1287. doi:10.1101/gad.3.9.1273. PMID 2558049.
  7. ^ Wilson, C; Pearson RK; Bellen HJ; O’Kane CJ; Grossniklaus U; Gehring WJ (September 1989). "P-element mediated enhancer detection: an efficient method for isolating and characterizing developmentally regulated genes in Drosophila". Genes & Development. 3 (9): 1301–1313. doi:10.1101/gad.3.9.1301. PMID 2558051.
  8. ^ O'Kane, CJ; Gehring WJ (December 1987). "Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila". Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24): 9123–9127. doi:10.1073/pnas.84.24.9123. PMC 299704. PMID 2827169.
  9. ^ Volger, G; Urban J (July 2008). "The transcription factor Zfh1 is involved in the regulation of neuropeptide expression and growth of larval neuromuscular junctions in Drosophila melanogaster". Developmental Biology. 319 (1): 78–85. doi:10.1016/j.ydbio.2008.04.008. PMID 18499094.
  10. ^ Vockley, Christopher M.; Guo, Cong; Majoros, William H.; Nodzenski, Michael; Scholtens, Denise M.; Hayes, M. Geoffrey; Lowe, William L.; Reddy, Timothy E. (2015-08-01). "Massively parallel quantification of the regulatory effects of noncoding genetic variation in a human cohort". Genome Research. 25 (8): 1206–1214. doi:10.1101/gr.190090.115. ISSN 1549-5469. PMC 4510004. PMID 26084464.
  11. ^ Vockley, Christopher M.; D’Ippolito, Anthony M.; McDowell, Ian C.; Majoros, William H.; Safi, Alexias; Song, Lingyun; Crawford, Gregory E.; Reddy, Timothy E. (2015-08-25). "Direct GR Binding Sites Potentiate Clusters of TF Binding across the Human Genome". Cell. 166 (5): 1269–1281. doi:10.1016/j.cell.2016.07.049. ISSN 0092-8674. PMC 5046229. PMID 27565349.
  12. ^ Vanhille L, A. Griffon, M.A. Maqbool, J. Zacarias, L.T.M. Dao, N. Fernandez, B. B. Balester, J.C. Andrau, S. Spicuglia(2015년)CapStarr-seq: 포유류에서 강화제 활성을 정량적으로 평가하기 위한 고투과 방법.냇. 코뮌.6:6905.