서스펜션 어레이 기술

Suspension array technology

서스펜션 어레이 기술(또는 SAT)은 분자생물학에 사용되는 높은 처리량, 대규모, 다중화된 선별 플랫폼이다.SAT는 단일 뉴클레오티드 폴리모르피즘(SNP) 유전자형 검사, 유전질환 검사, 유전자 발현 프로파일링, 약물 발견 선별, 임상 진단 등 유전체 및 단백질 연구에 광범위하게 적용돼 왔다.[1][2][3]SAT는 마이크로스피어 비드(직경 5.6 um)를 사용해 배열을 준비한다.SAT는 마이크로스피어 비드의 각 타입이 광학적 성질의 변화에 기초하여 고유한 식별을 가지기 때문에 이러한 마이크로스피어 비드의 사용을 통해 복수의 유전자 변형을 동시에 시험할 수 있도록 하고 있으며, 가장 일반적인 것은 형광색이다.색채의 각 색상과 강도는 고유한 파장을 가지고 있기 때문에 구슬은 파장 강도에 따라 쉽게 구별할 수 있다.마이크로스피어는 용액에서 쉽게 보류할 수 있으며 검사 중에 유리한 운동성을 보인다.평평한 미세조영(예: DNA 마이크로 어레이)과 비슷하게, DNA 올리고뉴클레오티드 프로브, 항체 또는 다른 단백질과 같은 적절한 수용체 분자가 다르게 라벨이 붙은 미세조영체에 자신을 부착한다.이것은 수천 개의 마이크로스피어 어레이 요소를 생산한다.프로브-표적 잡종화는 대개 광학적으로 표적에 의해 검출되며, 표적은 표본 내 각 표적의 상대적 풍부성을 결정한다.[4]

DNA 복합화를 이용한 SAT 개요

DNA 혼합을 모델로 사용한 서스펜션 어레이 기술 절차 개요.

DNA는 테스트 파편을 만드는 데 사용되는 세포에서 추출된다.이 시험 조각들은 다양한 마이크로스피어 비드를 함유한 용액에 첨가된다.각각의 마이크로스피어 비드는 독특한 형광 정체성을 가진 알려진 DNA 탐침을 포함하고 있다.마이크로스피어 비드의 시험 파편과 프로브는 서로 혼합될 수 있다.일단 잡종화되면, 마이크로스피어 비드는 분류되는데, 보통 흐름 세포계를 사용한다.이를 통해 원본 샘플에서 각각의 유전자 변형을 검출할 수 있다.수집된 결과 데이터는 각 혼합된 샘플이 마이크로스피어에 상대적인 풍부함을 나타낼 것이다.

멀티플렉싱

마이크로스피어 비드는 용액에서 쉽게 매달리고, 각 마이크로스피어는 시험 샘플에 교배하면 그 정체성을 유지하기 때문에 일반적인 서스펜션 배열 실험은 "다중화"라고 불리는 하나의 반응으로 광범위한 생물학적 분석을 분석할 수 있다.일반적으로 배열에서 사용되는 각 유형의 마이크로스피어는 개별적으로 대량으로 준비된다.예를 들어, Luminex xMAP 기술의 상용화된 마이크로sphere 어레이는 10X10 요소 어레이를 사용한다.이 배열은 각각 10개의 다른 강도를 가진 적외선 염료와 적외선 염료를 가진 구슬을 사용하여 100개의 원소를 배열한다.[4]따라서 복수 염료를 사용하면 배열 크기가 기하급수적으로 증가할 것이다.예를 들어, 염료당 10개의 다른 강도를 가진 5개의 다른 염료는 10만 개의 다른 배열 요소를 발생시킬 것이다.

절차

샘플 타겟팅

다른 종류의 미세세포를 사용할 때, SAT는 주어진 샘플에서 DNA와 단백질과 같은 여러 변수를 동시에 테스트할 수 있다.이를 통해 SAT는 단일 반응 동안 다양한 분자 표적을 분석할 수 있다.공통 핵산 검출법에는 직접 DNA 교배법이 포함된다.직접 DNA 혼합 접근방식은 마이크로스피어에 부착된 15~20BP DNA 올리고뉴클레오티드가 PCR을 사용하여 증폭되는 가장 간단한 서스펜션 배열 측정이다.이는 프로브-타겟 하이브리드화 과정에서 서로 다른 프로브 사이의 용해 온도 변동을 최소화해 최적화된 프로브 길이다.[1]관심 있는 DNA 과점 하나를 증폭시킨 후, 각각 100개의 잠재적 목표물을 포착할 수 있는 능력을 가진 100개의 서로 다른 마이크로스피어 세트에 100개의 다른 탐침을 만드는 데 사용할 수 있다.마찬가지로 대상 DNA 샘플은 대개 PCR이 증폭되고 라벨이 붙는다.[4]포획 탐침과 표적 DNA 사이의 잡종화는 보완 대상 DNA 시퀀스를 마이크로스피어에 위치한 포획 탐침으로 녹여 제거함으로써 달성된다.시퀀스 간 비특정 결합을 제거하기 위해 세척한 후 강하게 쌍을 이룬 프로브-타겟만 하이브리드 상태로 유지된다.[1]

흐름 시토메트릭을 통한 정렬 및 감지

이 항목에 대한 자세한 내용은 흐름 측량법을 참조하십시오.

각 마이크로스피어의 광학정체성을 알 수 있기 때문에 한 마이크로스피어 세트의 표적마커와 흐름 시토메트리를 사용하여 다른 미세스페이스 세트의 표적마커의 상대적 강도를 비교함으로써 마이크로스피어에 혼합된 표적시료의 정량화를 달성할 수 있다.마이크로스피어는 고유한 광학적 특성과 목표 시퀀스에 대한 혼합 수준을 모두 사용하여 정렬할 수 있다.

힘

  • 빠른 처리량/높은 처리량:멀티플렉스 분석에서는 매 30초마다 100플렉스 검사를 분석할 수 있다.최근 보고된 고투과 흐름 시토메트리는 1분 만에 96웰 플레이트를 샘플링할 수 있으며, 이론적으로 이 시스템을 이용한 100플렉스 검사를 1초 미만에 분석하거나 하루 1200만개의 샘플을 전달할 수 있다.[4]
  • 고배열 밀도/다중배열: 평탄한 마이크로레이와 비교했을 때 SAT는 병렬 측정을 할 수 있다.마이크로스피어 몇 마이크로리터는 수천 개의 배열 요소를 포함할 수 있으며 각 배열 요소는 수백 개의 개별 마이크로스피어로 표현된다.따라서 흐름 Cytometry에 의한 측정은 각 배열 요소의 반복 분석을 나타낸다.[4]
  • 효과적인 정보 수집:SAT를 사용할 때의 장점 중 하나는 환자나 연구 유기체로부터 하나의 샘플을 채취하여 여러 유전자 변형을 동시에 검사할 수 있다는 것이다.따라서 단일 샘플에서 환자가 일련의 바이러스로부터 어떤 바이러스를 가지고 있는지 또는 고유한 표현형을 가진 유기체에 어떤 염기쌍 돌연변이가 존재하는지 판단할 수 있다.[3]
  • 비용 효과적: 현재 상용화된 서스펜션 어레이 키트는 테스트 시퀀스당 $0.10~$0.25의 비용이 든다.[1]

약점

  • 상대적으로 낮은 배열 크기:수백만 개의 서로 다른 어레이 요소를 생성하기 위해 염료를 증가시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있지만, 현재 상용화된 마이크로sphere 어레이의 세대(Luminex xMAP 기술로부터)는 두 세트의 염료만을 사용하므로 실험당 최대 100개의 표적만 검출할 수 있다.[4]
  • 서로 다른 일련의 프로브와 표적 시퀀스 사이의 하이브리드화는 특정한 어닐링 온도를 필요로 하는데, 이는 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이와 순서에 의해 영향을 받는다.따라서 모든 실험에서 가능한 어닐링 온도 하나만 사용할 수 있다.따라서 주어진 실험에 사용되는 모든 탐침은 동일한 온도에서 목표물에 혼합되도록 설계되어야 한다.일부 프로브 세트에 기본 쌍 불일치를 도입하면 각 프로브 세트 간의 어닐링 온도 차이를 최소화할 수 있지만, 한 번의 반응으로 10-20개 이상의 표적을 테스트할 경우 하이브리드화 문제는 여전히 중요하다.[1]

참조

  1. ^ a b c d e Dunbar, Sherry A. (2006). "Applications of Luminex xMAP technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection". Clinica Chimica Acta. 363 (1–2): 71–82. doi:10.1016/j.cccn.2005.06.023. PMC 7124242. PMID 16102740.
  2. ^ Seideman, Jonathan; Peritt, David (2002). "A novel monoclonal antibody screening method using Luminex-100 microsphere system". Journal of Immunological Methods. 267 (2): 165–171. doi:10.1016/s0022-1759(02)00168-0. PMID 12165438.
  3. ^ a b Dunbar, Sherry A.; Vander Zee, Coe A.; Oliver, Kerry G.; Karem, Kevin L.; Jacobson, James W. (2003). "Quantitative, multiplexed detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP system". Journal of Microbiological Methods. 53 (2): 245–252. doi:10.1016/S0167-7012(03)00028-9. PMID 12654495.
  4. ^ a b c d e f Nolan, John P.; Sklar, Larry A. (2002). "Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm". Trends in Biotechnology. 20 (1): 9–12. doi:10.1016/s0167-7799(01)01844-3. PMID 11742671.

외부 링크