3타입 분비 시스템

Type three secretion system
살모넬라 장티푸륨으로부터 격리된 T3SS 바늘 복합체의 전송 전자 마이크로스코프 이미지

Type 3 분비 시스템(종종 Type III 분비 시스템 및 약칭 TTSS 또는 T3SS, Injectisome이라고도 함)은 여러 그램 음성 박테리아에서 발견되는 단백질 첨가물이다.

병원성 박테리아에서는 바늘과 같은 구조가 진핵생물의 존재를 감지하고 박테리아 감염을 돕는 단백질을 분비하는 감각 탐사로 사용된다.분비된 이펙터 단백질은 박테리아 세포에서 직접 진핵세포(숙주) 세포로 분비되는데, 이 세포들은 병원체가 생존하고 면역 반응에서 탈출하는 데 도움을 주는 여러 가지 효과를 발휘한다.

개요

Type III 분비 시스템이라는 용어는 1993년에 만들어졌다.[1]이 분비 시스템은 그람 음성 박테리아에서 발견된 최소 5개의 다른 분비 시스템과 구별된다.많은 동식물 관련 박테리아는 유사한 T3SS를 가지고 있다.이러한 T3SS는 서로 다른 진화의 결과와 유사하며, 혈전학적 분석은 그램 음성 박테리아가 T3SS 유전자 카세트를 다른 종으로 수평으로 전송할 수 있는 모델을 지원한다.The most researched T3SSs are from species of Shigella (causes bacillary dysentery), Salmonella (typhoid fever), Escherichia coli (Gut flora, some strains cause food poisoning), Vibrio (gastroenteritis and diarrhea), Burkholderia (glanders), Yersinia (plague), Chlamydia (sexually transmitted disease), Pseudomonas (infects humans, animals and plants) 및 식물 병원체 에르위니아, 랄스토니아 및 크산토모나스, 식물 공생 Rhizobium.

T3SS는 약 30개의 다른 단백질로 구성되어 있어 가장 복잡한 분비 시스템 중 하나이다.그것의 구조는 박테리아 플라겔라(운동성을 위해 사용되는 길고 단단한 세포외 구조)와 많은 유사점을 보여준다.T3SS에 참여하는 단백질 중 일부는 아미노산 염기서열 호몰로지(homology)와 편백질(plagellar prote)을 공유한다.T3SS를 보유한 박테리아 중 일부는 플라겔라를 가지고 있고 운동성 세균(예: 살모넬라), 일부는 그렇지 않다(예: 시겔라).기술적으로 말하면 타입 III 분비물은 감염 관련 단백질과 편평성분을 분비하는 데 모두 사용된다.그러나 주로 감염기기와 관련하여 "타입 III 분비물"이라는 용어가 사용된다.세균성 편모세포는 타입 III 분비 시스템과 공통의 조상을 공유한다.[2][3]

T3SS는 많은 병원성 박테리아의 병원성(감염 능력)에 필수적이다.T3SS의 결함은 박테리아를 비병원성으로 만들 수 있다.그램 음성 박테리아의 일부 비침습성 균주는 정력적으로 비용이 많이 드는 시스템을 더 이상 사용하지 않기 때문에 T3SS를 잃었다고 제안되었다.[4]과거에는 전통적인 항생제가 이러한 박테리아에 효과적이었지만, 항생제 내성 균주는 끊임없이 생겨난다.T3SS의 작동 방식을 이해하고 그것을 구체적으로 목표로 하는 약품을 개발하는 것은 1990년대 후반부터 전 세계 많은 연구 단체들의 중요한 목표가 되었다.

구조

III형 분비 시스템
T3SS needle complex.svg
T3SS 니들 복합체
식별자
기호T3SS
TCDB1.B.22
OPM 슈퍼 패밀리348
OPM단백질5tcq

T3SS의 표시는 바늘[5][6](더 일반적으로 니들 콤플렉스(NC) 또는 T3SS 장비(T3SA)이며, ATPase를 제외할 때 주입체라고도 한다. 아래를 참조한다.분비되어야 하는 박테리아 단백질은 박테리아 세포질에서 바늘을 통해 숙주 세포질 속으로 직접 통과한다.세 개의 막이 그람 음성 박테리아의 이중막(내막과 외막)과 진핵막이라는 두 개의 세포막을 분리한다.바늘은 매우 선택적이고 거의 불침투성인 막을 매끄럽게 통과한다.단일 박테리아는 수백 개의 바늘 콤플렉스를 막 전체에 퍼뜨릴 수 있다.바늘단지는 병원성 세균의 모든 T3SS의 보편적인 특징이라고 제안되었다.[7]

바늘 콤플렉스는 박테리아의 세포질에서 시작하여 두 막을 가로질러 세포로부터 돌출한다.막에 고정된 부분은 T3SS의 베이스(또는 베이스 본체)이다.세포외 부분은 바늘이다.이른바 내측봉은 바늘과 밑동을 연결한다.바늘 자체는 T3SS의 가장 크고 가장 두드러진 부분이지만 단일 단백질의 많은 단위로 만들어진다.그러므로 서로 다른 T3SS 단백질의 대부분은 기지를 구축하는 단백질과 숙주에 분비되는 단백질이다.위에서 언급했듯이 바늘 콤플렉스는 박테리아 플라겔라와 유사성을 공유한다.좀 더 구체적으로 말하면, 바늘 단지의 밑부분은 구조적으로 평판 베이스와 매우 유사하다; 바늘 자체는 평판 필라멘트와 연결되는 구조인 평판 후크와 유사하다.[8][9]

기단은 여러 개의 원형 고리로 이루어져 있으며, 새로운 바늘 단지에 최초로 만들어진 구조물이다.베이스가 완성되면 외단백질(바늘)의 분비기계 역할을 한다.전체 콤플렉스가 완성되면 시스템은 숙주 세포로 전달되는 단백질을 분비하는 것으로 전환된다.바늘은 아래에서 위로 쌓이는 것으로 추정된다; 바늘 단량체 단백질은 서로 쌓여서 바늘 끝에 있는 단위가 마지막으로 추가된 것이다.니들 서브유닛은 약 9 kDa로 측정되는 가장 작은 T3SS 단백질 중 하나이다. 100-150 서브유닛은 각 니들을 구성한다.

T3SS Needle의 길이는 약 60-80nm, 외부 폭은 8nm이다.다른 세포외 박테리아 구조(예를 들어, 접착제와 지용성당층)가 분비에 지장을 주지 않도록 최소한의 길이를 가져야 한다.바늘 구멍은 직경이 3nm이다.접힌 이펙터 단백질은 대부분 바늘구멍을 통과하기에는 너무 크기 때문에 분비된 단백질은 대부분 펴진 바늘을 통과해야 하는데, 이는 구조물의 밑부분에 있는 ATPase에 의해 수행되는 작업이다.[10]

T3SS 단백질

살모넬라 장티푸리움에서 나온 바늘 복합체의 개별 하부구조 다이어그램

T3SS 단백질은 세 가지 범주로 분류될 수 있다.

  • 구조 단백질: 밑부분, 안쪽 막대기, 바늘을 만든다.
  • 이펙터 단백질: 숙주세포에 분비되어 감염을 촉진하거나 숙주세포 방어막을 억제한다.
  • 샤페로네(Chaperones): 박테리아 세포질에 이펙터를 결합하고, 집적과 열화로부터 보호하며, 바늘 콤플렉스로 향하게 한다.

대부분의 T3SS 유전자는 피연산자로 배열되어 있다.이 오피니언들은 어떤 종에서는 박테리아 염색체에, 다른 종에서는 전용 플라스미드에 위치한다.예를 들어 살모넬라균은 T3SS 유전자가 대부분 모이는 염색체 부위, 이른바 살모넬라 병원성 섬(SPI)을 갖고 있다.반면에 시겔라는 모든 T3SS 유전자가 존재하는 큰 독성 플라스미드를 가지고 있다.많은 병원성 섬과 플라스미드는 섬/플라스미드를 새로운 종으로 자주 수평적 유전자로 전이할 수 있는 원소를 포함하고 있다는 점에 유의해야 한다.

바늘을 통해 분비되어야 할 이펙터 단백질은 수천 개의 다른 단백질과 함께 세포질 내에 떠 있기 때문에 시스템에 의해 인식될 필요가 있다.인식은 분비 신호, 즉 바늘 콤플렉스가 인식할 수 있는 단백질(대개 처음 20개 아미노산 내)의 시작(N-terminus)에 위치한 짧은 아미노산 시퀀스를 통해 이루어진다.다른 분비 시스템과 달리 T3SS 단백질의 분비 신호는 절대 단백질을 분리하지 않는다.

분비 유도

니들이 호스트 셀과 접촉하면 T3SS가 분비되기 시작한다.[11] 이 트리거 메커니즘에 대해서는 잘 알려져 있지 않다(아래 참조).분비는 또한 성장배지에서 칼슘 이온의 농도를 낮추고(예르시니아와 필로모나스의 경우, EDTA 또는 EGTA와 같은 첼토레이터를 첨가하여), 예를 들어 방향성 염료 콩고 빨강을 성장배지(시겔라)에 첨가함으로써 유도될 수 있다.이러한 방법 등은 타입 III 분비를 인위적으로 유도하기 위해 실험실에서 사용된다.

숙주 세포와의 접촉 이외의 외부 단서에 의한 분비 유도는 또한 감염된 유기체에서 체내에서도 일어난다.이 박테리아는 온도, pH, 삼몰래, 산소 수준과 같은 단위를 감지하여 T3SS 활성화 여부를 "결정"하는 데 사용한다.예를 들어 살모넬라균은 동물의 장에서 복제하여 침입하는 것이 동물 장에서보다 이음에서 더 잘 침입할 수 있다.이 박테리아는 이 지역에 존재하는 다른 이온들 덕분에 그들이 어디에 있는지 알 수 있다; 이움에는 형질과 아세테이트가 들어 있지만, 체쿰은 그렇지 않다.박테리아는 이 분자들을 감지하고, 그들이 염소에 있다고 판단하고 분비 기계를 작동시킨다.프로피온산이나 부티레이트처럼 체내에 존재하는 분자는 박테리아에 부정적인 신호를 주고 분비를 억제한다.대부분의 진핵 세포막에서 발견되는 지질인 콜레스테롤은 시겔라에서 분비를 유도할 수 있다.

위에 열거된 외부 단서는 분비를 직접 조절하거나 유전적 메커니즘을 통해 조절한다.T3SS 유전자의 발현을 조절하는 여러 가지 전사 인자가 알려져 있다.T3SS 이펙터를 묶는 일부 보호막도 전사 인자의 역할을 한다.피드백 메커니즘이 제안되었다: 박테리아가 분비되지 않을 때, 박테리아의 이펙터 단백질은 세포질에서 보호되고 떠다니게 된다.분비물이 시작되면 보호자는 이펙터에서 분리되고 후자는 분비되어 세포에서 나온다.그 후 외로운 보호자는 유전자에 결합하여 그들의 효과자를 암호화하고 그 전사들을 유도하여 더 많은 효과자를 만들어 내는 전사 인자의 역할을 한다.

유형3과 유사한 구조SS 주입법은 박테리아 분비물을 진핵 숙주나 다른 표적 세포에 전달하기 위해 표적이 된 외부 막 Vesicle을 체내에서 방출하는 것을 돕기 위해 리벳 그램의 박테리아 외부와 내부 막에 제안되었다.[12]

T3SS 매개 감염

T3SS 이펙터는 기저부의 바늘 콤플렉스로 들어가 바늘 안쪽으로 숙주 셀을 향해 나아간다.이펙터가 호스트에 들어가는 정확한 방법은 대부분 알려져 있지 않다.바늘 자체는 숙주 세포막에 구멍을 뚫을 수 있다고 이전에 제안되었다; 이 이론은 반박되었다.이제 집합적으로 명명된 일부 이펙터가 먼저 분비되어 숙주 세포막에서 다른 이펙터가 들어갈 수 있는 모공이나 채널(반투명)을 생성한다는 것이 명백해졌다.번역기가 부족한 돌연변이 박테리아는 단백질을 분비할 수는 있지만 숙주 세포로 전달하지는 못한다.일반적으로 각 T3SS는 세 개의 변환기를 포함한다.일부 번역자들은 이중 역할을 한다; 그들이 모공 형성에 참여한 후에 그들은 세포 안으로 들어가서 진정한 의미의 피이드 이펙터 역할을 한다.

T3SS 이펙터는 여러 가지 방법으로 호스트 셀을 조작한다.가장 두드러진 효과는 숙주세포에 의한 박테리아 흡수 촉진이다.T3SS를 보유한 많은 박테리아가 복제를 하고 감염을 전파하기 위해서는 숙주세포에 들어가야 한다.그들이 숙주 세포에 주입하는 이펙터는 숙주가 박테리아를 삼키도록 유도하고 사실상 "먹도록" 유도한다.이를 위해 박테리아 이펙터는 숙주세포의 액틴 중합 기계를 조작한다.액틴은 세포골격의 구성요소로서 운동성과 세포형태의 변화에도 관여한다.그것의 T3SS 이펙터를 통해 박테리아는 숙주 세포의 자신의 기계를 자신의 이익을 위해 활용할 수 있다.일단 박테리아가 세포에 들어가면 다른 이펙터를 더 쉽게 분비할 수 있고 이웃 세포에 침투하여 조직 전체를 빠르게 감염시킬 수 있다.

T3SS 이펙터도 숙주의 셀 주기를 변조하는 것으로 나타났으며, 그들 중 일부는 사멸을 유도할 수 있다.가장 많이 연구된 T3SS 이펙터 중 하나는 시겔라 플렉스네리의 IpaB이다.그것은 호스트 세포막에 모공을 형성하고 이펙터로서 호스트 세포에 여러 가지 해로운 영향을 미치는 이중 역할을 한다.IpaB는 동물 면역 체계의 세포인 대식세포에 사멸을 유발한다는 것이 입증되었다.[13]나중에 IpaB가 진핵 세포의 주요 조절 단백질인 카스파아제 1과 상호작용하여 이를 달성한다는 것이 밝혀졌다.[14]

T3SS 이펙터의 또 다른 잘 특징지어지는 등급은 크산토모나스의 TAL 이펙터(TAL Effector)이다.이 단백질들은 식물에 주입되면 식물 세포의 핵으로 들어가 식물 촉진자 서열을 묶고 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다.[15]TAL 이펙터-DNA 인식은 최근 간단한 코드를[16][17] 구성하는 것으로 입증되었으며, 이는 이러한 단백질이 어떻게 숙주 식물 세포에서 유전자의 전사를 변화시킬 수 있는지에 대한 이해를 크게 향상시켰다.

해결되지 않은 문제

살모넬라 바늘 콤플렉스의 토폴로지 및 조직.[18]

T3SS에 관한 수백 개의 기사가 90년대 중반부터 발표되었다.그러나 시스템에 관한 수많은 문제는 해결되지 않은 채로 남아 있다.

  • T3SS 단백질.각 유기체에서 10개 미만인 약 30개의 T3SS 단백질 중 생화학적 방법을 사용하여 직접 검출되었다.나머지는 아마도 희귀한 것으로서 발견하기 어려운 것으로 증명되었고 그것들은 이론적인 것으로 남아 있다(많은 T3SS 유전자/단백질에서 생화학적 연구가 아닌 유전학적 연구가 수행되었지만).각 단백질의 국산화도 완전히 알려진 것은 아니다.
  • 바늘 길이.새로운 바늘이 적절한 길이에 도달했을 때 박테리아가 어떻게 "알고 있는지" 알 수 없다.몇 가지 이론이 존재하는데, 그 중에는 어떻게든 바늘 끝과 밑부분을 연결하는 '루러 단백질'의 존재도 있다.바늘 끝에 새로운 모노머를 추가하면 눈금자 단백질을 늘려서 바늘 길이를 밑단까지 표시해야 한다.
  • 정력적이다.바늘 안에 있는 단백질의 통로를 움직이는 힘은 완전히 알려져 있지 않다.ATPase는 T3SS의 기저부와 연관되어 있고 바늘로 단백질을 유도하는데 참여하지만 그것이 수송을 위한 에너지를 공급하는지 여부는 명확하지 않다.
  • 분비물 신호.위에서 언급한 바와 같이 이펙터 단백질에 분비 신호의 존재가 알려져 있다.이 신호는 이 시스템이 T3SS로 전달된 단백질을 다른 단백질과 구별할 수 있게 해준다.그 성격, 요건, 인식 메커니즘은 잘 이해되지 않지만, 제3형 분비 시스템으로 어떤 세균 단백질이 운반될 수 있는지를 예측하는 방법이 최근에 개발되었다.[19]
  • 분비물의 활성화.박테리아는 언제 이펙터를 분비하는 것이 적절한지 알아야 한다.불필요한 분비는, 숙주 세포가 근처에 없을 때, 에너지와 자원 면에서 박테리아에게 낭비된다.그 박테리아는 어떻게 해서든 숙주세포와 바늘의 접촉을 인식할 수 있다.이것이 어떻게 이루어지는지는 여전히 연구되고 있으며, 그 방법은 병원체에 의존하는 것이 당연하다.어떤 이론들은 숙주 세포와 접촉할 때 바늘 구조의 미묘한 순응적 변화를 가정한다; 이 변화는 아마도 기지가 분비를 시작하도록 하는 신호로 작용할 것이다.살모넬라에서 한 가지 인식 방법이 발견되었는데, 살모넬라에서는 이펙터의 분비를 켜기 위해 병균성 섬 2 인코딩 T3SS를 통해 숙주 세포 세포 세포 pH를 감지하는 것에 의존하고 있다.[20]
  • 보호자의 결합.샤퍼론이 언제 (번역 중이든 후이든) 그들의 이펙터를 묶는지 그리고 분비 전에 이펙터와 어떻게 분리되는지는 알려져 있지 않다.
  • 이펙터 메커니즘.비록 T3SS 이펙터가 숙주를 조종하는 방법에 대해 21세기 초부터 많은 것이 밝혀졌지만, 대부분의 효과와 경로는 여전히 알려져 있지 않다.
  • 진화.전술한 바와 같이 T3SS는 박테리아성 편모세포와 밀접한 관련이 있다.[21]경쟁 가설은 세 가지가 있다:[22] 첫째, 편평체가 먼저 진화했고 T3SS가 그 구조에서 유래했다는 가설, 둘째, T3SS가 먼저 진화했고 편평한 구조에서 유래했다는 가설, 셋째, 두 구조가 공통의 조상으로부터 유래되었다는 것이다.두 구조 사이의 단백질 동질성과 기능적 다양성을 모두 설명하기 때문에 여러 시나리오에 대해 약간의 논란이 있었다.[2][22][23]그러나 최근의 유전체학 증거는 T3SS가 초기 유전자 손실과 유전자 획득을 수반하는 과정에 의해 편모세포에서 파생되었다는 가설을 지지한다.[24]후자 프로세스의 핵심 단계는 다른 막 관련 시스템에서 최소한 세 번 이상 발생한 사건인 T3SS에 대한 비밀 요원의 모집이었다.

T3SS 단백질 명명법

그램 음성 박테리아의 플라겔룸.기저부의 고리는 바늘단지에 C-링의 존재는 입증되지 않았지만 바늘단추와 매우 유사하다.평판 후크는 T3SS 바늘과 동일하다.

1990년대 초부터 새로운 T3SS 단백질이 다른 박테리아 종에서 꾸준히 발견되고 있다.약어는 각 유기체의 단백질 시리즈별로 독립적으로 주어졌으며, 이름은 대개 단백질의 기능에 대해 별로 드러나지 않는다.다른 박테리아에서 독립적으로 발견된 몇몇 단백질은 나중에 동음이의어로 판명되었다; 그러나 역사적 명칭은 대부분 유지되어 혼동을 일으킬 수 있는 사실이었다.예를 들어, SicA, IpgC, SycD라는 단백질은 각각 살모넬라, 시겔라, 예르시니아에서 온 호몰로그램이지만, 그 이름의 마지막 글자("시리얼 번호")는 그것을 나타내지 않는다.

아래는 여러 T3SS를 포함하는 종에서 가장 일반적인 단백질 계열 이름을 요약한 것이다.이러한 이름에는 T3SS 기계를 구성하는 단백질뿐만 아니라 분비 이펙터 단백질도 포함된다.

  • 예르시니아
    • Yop: Yersinia 외단백질
    • Ysc: Yersinia 분비물(구성 요소)
    • Ypk: 예르시니아 단백질 키나아제
  • 살모넬라균
    • 스파: 항원의 표면 표시
    • 시치: 살모넬라 침공 샤페론
    • Sip : 살모넬라 침습단백질
    • Prg: PhoP 억제 유전자
    • Inv: 인베이젼
    • 조직: 산소 조절 유전자
    • ssp: 살모넬라 분비 단백질
    • Iag: 침공 관련 유전자
  • 시겔라
    • Ipg: 침공 플라스미드 유전자
    • 이파: 침공 플라스미드 항원
    • 음시: 이파의 막 표현
    • 스파: 항원의 표면 표시
    • 오스프: 외부 시겔라 단백질
  • 에스케리치아
    • Tir: 번역된 인티민 수용체
    • 9월: 대장균 단백질 분비
    • Esc : 에스케리치아 분비물(성분)
    • 에스프: 에스케리치아 분비 단백질
    • 체스: 대장균 분비의 샤페론
  • 녹모나스
    • Hrp: 과민 반응 및 병원성
    • Hrc: 과민성 응답 보존됨(또는 Hrp 보존됨)
  • 리조비움
    • 노프: 결절단백질
    • Rhc: 리조비움 보존
  • 몇 가지 종에서:
    • 처녀자리: 처녀자리
  • "프로토클라미디아 아메보필라"
  • "소달리스 글로시니디우스"[25]

그 줄임말 뒤에 글자나 숫자가 있다.글자는 보통 발견의 연대순이나 피연산자에 있는 유전자의 물리적 순서 중 하나인 "직렬번호"를 나타낸다.희귀한 경우인 숫자는 kDa에서 단백질의 분자량을 나타낸다.예:IpaA, IpaB, IpaC; MxiH, MxiG, MxiM; Spa9, Spa47.

모든 T3SS에는 바늘 모노머, 바늘의 안쪽 막대기, 링 단백질, 두 개의 변환기, 바늘끝 단백질, 눈금자 단백질(바늘의 길이를 결정하는 것으로 생각되며, 위 참조), 분비 에너지를 공급하는 ATPase 등 몇 가지 핵심 원소가 나타난다.다음 표는 4개의 T3SS 함유 박테리아에 포함된 주요 단백질 중 일부를 보여준다.

∘함수 / 속 → 시겔라 살모넬라균 예르시니아 에스케리치아
니들 모노머 음시H 프리지 YscF 에스케이프
이너 로드 음시이 프리지 YscI 에스시
바늘끝단백질 IpaD SipD LcrV 에스파
반역자 IpaB SipB 요프비 에스피디
반역자 IPAC SipC 요프디 에스프비
두 개의 변환기를 위한 샤페론 IpgC 시카 SycD CesD
ATPase 스파47 인비시 YscN SepB (EscN)
눈금자단백질 스파32 인비제이 YscP 오르프16
스위치 스파40 스파스 YscU 에스쿠
게이트키퍼 음시씨 인베이스 YopN (TyeA) SepL

T3SS 연구에 사용된 방법

T3SS 니들 복합체 격리

세포로부터 크고 연약한 소수성 멤브레인 구조를 분리하는 것은 오랜 세월 동안 하나의 도전이 되어왔다.그러나 1990년대 말까지 T3SS NC의 격리를 위한 몇 가지 접근법이 개발되었다.1998년 최초의 NC는 살모넬라 장티푸륨으로부터 격리되었다.[26]

이 격리를 위해 박테리아는 통나무 단계에 도달할 때까지 많은 양의 액체 성장 매개체에서 자란다.그런 다음 그것들은 원심분리된다; 상등성분(배지)은 폐기되고 펠릿(세균)은 일반적으로 리소자임과 때로는 LDAO 또는 트리톤 X-100과 같은 세제를 함유한 용해 완충액에 다시 붙인다.이 완충제는 세포벽을 분해한다.몇 차례의 용해와 세척 후에, 열린 박테리아는 일련의 초밀접화 과정을 겪게 된다.이 치료법은 큰 고분자 구조를 풍부하게 하고 더 작은 세포 구성요소를 제거한다.선택적으로 최종 리세이트는 CsCl 밀도 경사로에 의해 추가 정화를 받는다.

추가적인 정화를 위한 추가적인 접근법은 친화력 크로마토그래피를 사용한다.단백질 태그(예: 히스티딘 태그)를 운반하는 재조합형 T3SS 단백질은 분자복제에 의해 생성되어 연구된 박테리아에 도입(변형)된다.위에서 설명한 바와 같이 초기 NC 절연 후 리사이트는 태그에 친화력이 높은 입자로 코팅된 기둥을 통과한다(히스티딘 태그의 경우: 니켈 이온).태그가 붙은 단백질은 기둥에 유지되며, 그것과 함께 바늘 콤플렉스 전체가 유지된다.그러한 방법을 사용하면 높은 순도를 얻을 수 있다.이러한 순수성은 NC 특성화에 사용되어 온 많은 섬세한 어세이에서 필수적이다.

제3형 임팩터는 1990년대 초반부터 알려졌지만 숙주세포로 전달되는 방식은 전혀 미스테리였다.많은 플라겔라 단백질과 T3SS 단백질 사이의 동질학은 연구자들이 플라겔라와 유사한 외부 T3SS 구조의 존재를 의심하게 만들었다.바늘 구조의 식별과 그에 따른 격리를 통해 연구자들은 다음을 수행할 수 있었다.

  • NC의 3차원 구조를 자세히 특징짓고, 이를 통해 분비 메커니즘에 관한 결론을 도출한다(예를 들어 바늘의 좁은 폭은 분비 전에 이펙터를 펴야 한다는 것).
  • 격리된 바늘을 단백질 분석(아래 참조)으로 유도하여 NC의 단백질 성분을 분석한다.
  • T3SS 유전자를 박살내고 돌연변이 박테리아로부터 NC를 분리하고 돌연변이가 일으킨 변화를 조사함으로써 다양한 NC 부품에 역할을 부여한다.

현미경, 결정학 및 솔리드 스테이트 NMR

거의 모든 단백질과 마찬가지로 T3SS NC의 시각화는 전자현미경을 통해서만 가능하다.NC의 첫 번째 이미지(1998)는 살아있는 박테리아의 세포벽에서 돌출된 바늘 구조와 평평하고 2차원적인 격리된 NC를 보여주었다.[26]2001년에는 시겔라 플렉스네리(Sigella flexneri)의 NC 이미지를 디지털 방식으로 분석하여 평균화하여 NC의 첫 번째 세미 3D 구조를 얻었다.[5]시겔라 플렉스네리 NC의 헬리컬 구조는 2003년 X선 섬유 회절을 이용한 16 å의 결의로 해결되었으며,[27] 1년 후 살모넬라 장티푸리움 NC의 17 å 3D 구조가 간행되었다.[28]최근의 진전과 접근방식은 NC의 고해상도 3D 영상을 허용해 NC의 복잡한 구조를 더욱 명확히 하고 있다.[29][30]

많은 T3SS 단백질들이 수년간 결정화되었다.여기에는 NC의 구조 단백질, 이펙터 및 보호자가 포함된다.바늘 복합단층 모노머의 첫 번째 구조는 "Burkholderia philosomallei"의 BsaL의 NMR 구조였고, 이후 2006년에 모두 해결된 시겔라 플렉스네리의 MixH의 결정 구조였다.[31][32]

2012년, 재조합 야생형 바늘 생산, 고체 상태의 NMR, 전자 현미경[33] 검사, 로제타 모델링의 조합은 초분자 인터페이스와 궁극적으로 살모넬라 티티푸륨 T3SS 바늘의 완전한 원자 구조를 드러냈다.[34]80레시듀 PrgI 하위 단위는 살모넬라 장티푸륨의 편백과 유사하게 2회전당 약 11개의 서브유닛으로 오른손 헬리컬 어셈블리를 형성하는 것으로 나타났다.이 모델은 또한 바늘 표면에 위치한 확장된 아미노-단자 영역을 드러내었고, 반면 보존도가 높은 카복시 종단부는 루멘을 향한다.[34]

프로테오믹스

T3SS를 구성하는 단백질의 배열을 식별하기 위해 몇 가지 방법이 채택되었다.격리된 바늘 콤플렉스는 SDS-PAGE로 분리할 수 있다.염색 후 나타나는 띠는 겔에서 개별적으로 분해하여 단백질 염기서열과 질량분석을 이용하여 분석할 수 있다.NC의 구조 구성요소는 서로 분리될 수 있으며(예를 들어, 기저부로부터 바늘 부분) 이러한 분수를 분석함으로써 각각의 분수에 참여하는 단백질을 추론할 수 있다.또는 NC 프로테오메트의 전체 그림을 얻기 위해 이전의 전기영양 없이 질량 분광법으로 격리된 NC를 직접 분석할 수 있다.

유전 및 기능 연구

많은 박테리아의 T3SS는 연구자들에 의해 조작되었다.개별 조작의 영향을 관찰하는 것은 시스템의 각 구성요소의 역할에 대한 통찰력을 끌어내는 데 사용될 수 있다.조작의 예는 다음과 같다.

  • 하나 이상의 T3SS 유전자 삭제(gene knockout)
  • 하나 이상의 T3SS 유전자(즉, 평소보다 많은 양의 T3SS 단백질의 생체내 생성)의 과다압박.
  • T3SS 유전자 또는 단백질의 점 또는 국부적 변화.이것은 단백질의 특정 아미노산이나 부위의 기능을 정의하기 위해 행해진다.
  • 한 종의 박테리아에서 다른 종으로 유전자 또는 단백질의 유입(교차완성 검사)이는 두 T3SS 간의 차이와 유사성을 확인하기 위해 수행된다.

T3SS 구성요소의 조작은 박테리아 기능 및 병원성 측면의 여러 측면에 영향을 미칠 수 있다.가능한 영향의 예:

  • 세포내 병원균의 경우 숙주세포를 침입하는 박테리아의 능력.이는 침입 측정(젠타미닌 보호 측정)을 사용하여 측정할 수 있다.
  • 세포내 박테리아가 숙주 세포 사이를 이동하는 능력.
  • 숙주 세포를 죽이는 박테리아의 능력.이것은 여러 가지 방법으로 측정할 수 있는데, 예를 들어, 죽은 세포에서 누출되는 효소 LDH가 효소 활성을 측정하여 식별되는 LDH-release assay에 의해 측정된다.
  • 특정 단백질을 분비하거나 아예 분비하는 T3SS의 능력.이를 확인하기 위해 액체 매개체에서 자라는 박테리아에서 분비가 유도된다.박테리아와 매질은 원심분리(원심분리)에 의해 분리되고, 중분수(상등분수)는 분비된 단백질의 존재 여부를 분석한다.정상적으로 분비되는 단백질이 분비되는 것을 막기 위해 큰 분자를 인공적으로 붙일 수 있다.당시 분비되지 않은 단백질이 바늘 콤플렉스 바닥에 '박혀 있다'는 상태를 유지하면 분비가 효과적으로 차단된다.
  • 박테리아가 온전한 바늘 콤플렉스를 조립할 수 있는 능력.NC는 조작된 박테리아로부터 격리되어 현미경으로 검사할 수 있다.그러나 사소한 변화는 항상 현미경으로 감지할 수는 없다.
  • 살아있는 동물이나 식물을 감염시키는 박테리아의 능력.조작된 박테리아가 체외에서 숙주세포를 감염시킬 수 있는 것으로 보여도 살아있는 유기체에서 감염을 지속시키는 능력은 당연시 될 수 없다.
  • 다른 유전자의 발현 수준.이것은 특히 Northern Block과 RT-PCR과 같은 여러 가지 방법으로 분석될 수 있다.전체 게놈의 표현 수준은 마이크로 어레이로 측정할 수 있다.많은 타입 III 전사 요소와 규제 네트워크가 이러한 방법을 사용하여 발견되었다.
  • 박테리아의 성장과 건강.

T3SS의 억제제

그램 음성 박테리아에서 T3SS를 억제하는 몇 가지 화합물이 발견되었는데, 그 중에는 스트렙토미세스 종에 의해 자연적으로 생성되는 과디노민도 포함되어 있다.[35]T3SS도 억제하는 단핵항체가 개발되었다.[36]T3SS 단백질의 번역을 억제할 수 있는 항생제인 Aurodox는 시험관내 및 동물[37][38] 모델에서 T3SS 이펙터를 예방할 수 있는 것으로 나타났다.

타입 III 신호 펩타이드 예측 도구

참조

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