전송전자 극저온도법

Transmission electron cryomicroscopy
50000배 배율로 비정형 얼음에서 매달린 GroEL의 크라이오TEM 영상
크라이오에 의한 피치아 목회자의 알코올 산화제 구조TEM

일반적으로 극저온 전자 극저온증(Cryo-EM)으로 알려진 전송전자 극저온증(CryoTEM)은 극저온증(일반적으로 액체-질소 온도)에서 표본을 연구하는 전송전자 현미경(TEM)의 일종이다.[1]크라이오-EM은 구조 생물학에서 인기를 얻고 있다.[2]

트랜스미션 전자 극저온증의 효용성은 어떤 식으로든 착색되거나 고정되지 않은 시료를 관찰할 수 있게 해 본래의 환경에서 보여 주는 데서 기인한다.이는 어려울 수 있는 시료를 결정화하여 비생리학적 환경에 배치해야 하는 X선 결정학과는 대조적인 것으로, 때로는 기능적으로 무관한 순응적 변화를 초래할 수 있다.

전자 검출기 기술, 특히 DDE(Direct Electronic Detectors)와 보다 강력한 소프트웨어 영상 알고리즘의 발전으로 원자 근해능에서 고분자 구조를 결정할 수 있게 되었다.[3]이미징된 고분자에는 바이러스, 리보솜, 미토콘드리아, 이온 통로, 효소 복합체가 포함된다.크라이오-EM은 2018년부터 헤모글로빈(64kDa)[4] 크기의 구조물에 최대 1.8㎛ 해상도를 적용할 수 있다.[5]2019년에는 극저온 전자파 구조가 단백질 데이터 뱅크에 축적된 구조물의 2.5%를 차지했고,[6] 이 숫자는 계속 증가하고 있다.[7]극저온 전자파 단층촬영(cryo-ET)이 적용되며, 여기에서 기울어진 2D 영상에서 샘플의 3D 재구성이 생성된다.

개발

크라이오TEM의 원래 근거는 생물학적 표본에 대한 방사선 피해와 싸우기 위한 수단이었다.전자현미경으로 시료의 이미지를 수집하는 데 필요한 방사선량은 섬세한 구조물에 대한 시료 손상의 잠재적 원인이 될 수 있을 만큼 충분히 높다.게다가 전자현미경의 기둥에 요구되는 높은 진공상태는 표본의 환경을 상당히 혹독하게 만든다.

진공 문제는 부정적인 얼룩이 유입되어 부분적으로 해결되었지만, 부정적인 얼룩이 있더라도 생물학적 샘플은 시료의 탈수 시 구조적으로 붕괴되기 쉽다.시료를 승화 온도보다 낮은 얼음 속에 넣는 것은 초기에 고려되었던 가능성이었지만, 물은 얼었을 때 밀도가 낮은 결정 격자로 배열되는 경향이 있고, 이것은 그 안에 들어 있는 모든 것의 구조를 파괴할 수 있다.

1980년대 초, 고체 상태의 물리학을 연구하는 몇몇 그룹들은 고압 동결이나 플래시 동결 같은 다른 방법으로 유리 얼음 생산을 시도하고 있었다.1984년 유럽 분자생물학연구소의 자크 두보체트(Jacques Dubocheet)가 이끄는 연구진은 유리화된 물 층에 내장된 아데노바이러스의 모습을 보여 주었다.[8]본 논문은 일반적으로 크라이오-EM의 기원을 표시하는 것으로 여겨지고 있으며, 이 기법은 전 세계 수많은 연구소에서 일상화 될 정도로 발전되어 왔다.

이미징(80–300 kV)에 사용되는 전자의 에너지는 공밸런트 결합이 깨질 수 있을 정도로 충분히 높다.영상시료가 방사선 손상에 취약할 때는 영상 획득에 사용되는 전자노출을 제한할 필요가 있다.이러한 낮은 노출은 전문 소프트웨어를 사용하여 고해상도 지도를 얻기 위해 수천 또는 수백만 개의 동일한 냉동 분자의 이미지를 선택, 정렬 및 평균화할 것을 요구한다.직접 전자 검출기와 더 나은 계산 알고리즘의 도입으로 2012년에 구조적인 특징의 현저한 향상이 달성되었다.[1][2]

2015년 스크립스 국립분자현미경연구소의 브리짓 캐러거와 동료들은 크라이오-EM 구조를 3 å보다 미세한 분해능으로 결정하도록 개발하여 크라이오TEM을 기존의 X선 결정기술과 비교 가능하고 잠재적으로 우월한 도구로 격상시켰다.퀘스.[9][10] 이후 2015년[11] 박테리아 효소 β-갈락토시다아제의 2.2 å 구조, 2016년 글루탐산탈수소효소의 1.8 å 구조 등 고해상도 달성이 이뤄졌다.[12]크라이오-EM은 지카 바이러스를 비롯한 각종 바이러스의 구조를 결정하는 데도 사용돼 스플라이소솜 등 대형 복합체에도 적용됐다.[13][14]2017년 노벨 화학상은 '용액 내 생체분자의 고해상도 구조 결정을 위한 극저온 전자 현미경 개발' 공로로 자크 두보체트, 요아힘 프랭크, 리처드 헨더슨에게 공동 수상했다.[15]

생물 시료

박막

생물학적 물질은 전자 현미경 격자 위에 퍼지며 급속한 결빙에 의해 동결된 상태로 보존되며, 보통 액체 질소 온도에 가까운 액체 에탄에 보존된다.액체 질소 온도 또는 더 낮은 온도에서 시료를 유지함으로써 전자 현미경 기둥의 고진공 속으로 유입될 수 있다.대부분의 생물학적 표본은 방사선에 극도로 민감하므로 저선량 기법으로 이미징해야 한다(유용하게도, 전송 전자 극저온으로 방사선 손상에 대한 추가적인 보호 계수를 제공한다).

결과적으로, 그 이미지들은 극도로 시끄럽다.일부 생물학적 시스템의 경우 신호 대 잡음 비를 증가시키기 위해 영상을 평균화하고 단일 입자 분석이라고 알려진 기법을 사용하여 표본에 대한 고해상도 정보를 검색할 수 있다.일반적으로 이 접근법은 일부 제한된 순응적 이질성을 현재 연구할 수 있지만(예: 리보솜) 평균화하는 사물이 동일할 것을 요구한다.단백질 복합체 및 바이러스의 크라이오TEM 영상에서 3차원 재구성을 나노미터 이하 또는 원자 근해상도로 해결하여 이들 대형 조립체의 구조와 생물학에 대한 새로운 통찰이 가능해졌다.

또한 2-D 결정의 투과성 단백질이나 나선성 단백질 배열과 같이 순서가 정해진 단백질 배열의 분석은 시료에 대한 고해상도 정보를 제공할 수 있는 일종의 평균화를 허용한다.이 기술은 전자 결정학이라고 불린다.

유리구간

박막법은 다중 산란 이벤트가 없으면 전자가 두꺼운 시료를 교차할 수 없기 때문에 얇은 시료(일반적으로 < 500 nm)로 제한된다.두꺼운 시료는 에탄(두께가 최대 수십 μm)의 강하 동결(크리오픽스) 또는 고압 동결(최대 수백 μm)에 의해 더 일반적으로 유리화 될 수 있다.그런 다음 -135 °C(배전 온도) 미만의 온도에서 크라이울트라믹로템에 다이아몬드 칼을 넣어 얇은 부분(40~200 nm 두께)으로 절단할 수 있다.단면은 전자현미경 그리드에 수집되어 박막으로 유리화된 시료와 같은 방식으로 이미징된다.이 기법은 유리구간(CEMOVIS)의 전송전자 극저온도법 또는 냉동수화물구간의 전송전자 극저온도법이라고 한다.

재료시료

CryoTEM은 유리화된 생물 검체를 이미징할 수 있게 하는 것 외에도, 진공에서 너무 휘발성이 높은 재료 검체를 표준 상온 전자 현미경을 사용하여 이미지로 이미지화하는 데 사용할 수 있다.예를 들어 액체 고체 인터페이스의 유리화된 부분을 CryoTEM에 의해 분석을 위해 추출할 수 있으며,[16] 전자현미경의 진공에서 승화되기 쉬운 황을 CryoTEM에서 안정화시켜 이미징할 수 있다.[17]

Cryo-TEM의 이미지 처리

전자 현미경에서 대부분의 접근법에서 물질의 최고의 해상도 이미지를 얻으려고 노력하지만, 크라이오-TEM에서 항상 그런 것은 아니다.고해상도 이미지의 모든 이점 외에도 신호 대 노이즈 비율은 각 입자에 방향을 할당하지 못하게 하는 주요 장애물로 남아 있다.예를 들어, 극분자 복합체에서는 영상촬영 중 3D에서 2D로 투영되는 여러 가지 다른 구조물이 있는데, 이를 구분하지 않으면 영상처리 결과가 흐릿해진다.그래서 확률론적 접근법이 이런 유형의 조사에서 더욱 강력해지는 것이다.[18]오늘날 크라이오-EM 이미지 처리에서 널리 사용되는 두 가지 인기 접근법이 있는데, 이는 1998년에[19] 발견된 최대우도 접근법과 비교적 최근에 채택된 베이시안 접근법이다.[20]

최대우도 추정 접근법은 통계에서 이 필드에 도달한다.여기서 입자의 가능한 모든 방향은 결과 확률 분포를 얻기 위해 요약된다.우리는 이것을 입자가 이미지당 정확한 방향을 얻는 일반적인 최소 제곱 추정치와 비교할 수 있다.[21]이렇게 하면, 표본의 입자들은 해당 확률에 의해 가중된 계산 후에 "불투명한" 방향을 얻게 된다.모든 과정은 반복적이고 다음 반복이 있을 때마다 모델은 더 좋아진다.실제 구조를 밀접하게 나타내는 모델을 만들기 위한 좋은 조건은 데이터가 너무 많은 잡음을 가지지 않고 입자가 우선적인 방향을 갖지 않을 때입니다.최대우도접근법의 주요 단점은 결과가 초기 추정에 따라 달라지며 때때로 모델 최적화가 국소적 최소치에 고착될 수 있다는 것이다.[22]

현재 cryo-TEM에서 사용되고 있는 베이시안적 접근법은 본질적으로 경험적이다.이것은 입자의 분포가 원래 데이터세트를 기반으로 한다는 것을 의미한다.마찬가지로, 일반적인 베이지안 방법에서는 데이터가 관찰된 후에 변경되는 고정된 사전 확률이 있다.최대우도 추정과의 주요 차이점은 재구성 중 소음을 줄이면서 결과 지도를 평활화하는 데 도움이 되는 특수 재구성 용어에 있다.[21]지도 평활은 가우스 분포로 이전 확률을 가정하고 푸리에 공간의 데이터를 분석함으로써 발생한다.사전 지식과 데이터 집합 간의 연결이 설정되기 때문에 이미지 재구성의 객관성을 잠재적으로 증가시키는 인적 요인 오류가 발생할 가능성이 적다.[20]

새로운 크라이오-TEM 이미징 및 이미지 재구성의 새로운 방법을 통해 프로세스 자동화를 지원하는 새로운 소프트웨어 솔루션이 나타난다.3D 재구성을 위한 오픈소스 컴퓨터 프로그램 RELION(Regularized Likatio OptimizatioN)에서 실증적 베이지안 접근법이 시행된 후, 프로그램은 크라이오-TEM 분야에 널리 보급되었다.[23][24]재구성된 영상의 해상도를 향상시키고, 파이썬 언어를 이용한 다용도 스크립트 구현이 가능하며, 2D/3D 모델 분류나 de novo 모델 생성 등의 통상적인 작업을 실행한다.[25][26]

기술

크라이오템에서는 다양한 기법을 사용할 수 있다.[27]널리 사용되는 기술은 다음과 같다.

  1. 전자 결정학
    1. 2차원 결정체의 해석
    2. 헬리컬 필라멘트 또는 튜브의 분석
    3. 마이크로 크리스털 전자 회절(MicroED)[28][29][30][31]
  2. 단일 입자 분석(SPA)
    1. 시간해결 CryoTEM[32][33][34]
  3. 전자 극저온 촬영(cryoET)

참고 항목

참조

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추가 읽기

외부 링크

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극저온증