MNase-seq

MNase-seq
시퀀싱에 의한 MNase 소화

깊은 염기서열을 가진 마이크로코칼 [1][2][3][4]뉴클레아제 소화의 줄임말인 MNase-seq는 2006년 C. elegans [5]게놈의 뉴클레오솜 점유율을 측정하기 위해 처음 개척된 분자생물학적 기술이며 2008년 [2]인간 게놈에 적용되었다.그러나 'MNase-seq'라는 용어는 1년 후인 [3]2009년에야 만들어졌다.간단히 말해서, 이 기술은 염색질에서 단백질 결합되지 않은 DNA 영역을 결합 및 절단하기 위해 비특이적 핵산내분해효소인 황색포도상구균 유래 효소인 마이크로코칼 뉴클레아제의 사용에 의존한다.히스톤 또는 다른 염색질 결합 단백질에 결합된 DNA(예: 전사인자)는 소화되지 않은 상태로 남아 있을 수 있다.그리고 나서 절단되지 않은 DNA는 단백질로부터 정제되고 다양한 Next-Generation 배열 방법 [6]중 하나 이상을 통해 배열된다.

MNase-seq는 염색질 접근성 분석을 통해 후생유전자의 상태를 평가하기 위해 사용되는 4가지 방법 중 하나이다.기타 3가지 기술은 DNase-seq, FAIR-seq [4]및 ATAC-seq입니다.반면 MNase-seq 주로 DNA순서 지역 histones 또는 다른 chromatin-bound은 다른 3proteins,[2]수밖에 없는 데 사용됩니다 Deoxyribonuclease 나는 극도로 민감한 사이트들 염색질 proteins,[8]또는 상표의 교차를 통해 느슨하게 포장된 염색질의 염기 서열 결정 법 지역에서 DNA를 얽매이지 않순서(DHSs)[7]일반적으로 매핑:에 사용된다.ers,[9][10]실체딱 [4]부러지게

역사

마이크로코칼핵산가수분해효소(MNase)[11]는 1956년 황색포도상구균에서 처음 발견되었고 1966년 [12]단백질이 결정화되었으며 1967년에 [13]특징지어졌다.크로마틴의 MNase 소화는 크로마틴 구조의 초기 연구에 핵심이었다. 크로마틴의 각 핵염색체 단위가 [14]약 200bp의 DNA로 구성되었음을 결정하는 데 사용되었다.이것은 올린스와 올린의 "줄에 달린 구슬"[15] 모델과 함께, 기본적인 염색질 [16]구조에 대한 콘버그의 생각을 확인시켜 주었다.추가 연구에서 MNase는 140bp보다 짧은 히스톤 결합 DNA를 분해할 수 없으며 DNase I 및 II는 결합 DNA를 10bp까지 [17][18]분해할 수 있는 것으로 밝혀졌다.이는 궁극적으로 뉴클레오솜 [19]핵심을 감싸고 있는 146bp의 DNA, 50bp의 링커 DNA가 각 [20]뉴클레오솜을 연결하고,[18] 10개의 연속적인 염기쌍의 DNA가 간격을 두고 뉴클레오솜 핵심에 단단히 결합한다는 것을 설명했다.

크로마틴 구조를 연구하기 위해 사용될 뿐만 아니라,[21] 마이크로코칼 뉴클레아제 소화는 1967년 특성화 이후 올리고뉴클레오티드 염기서열결정 실험에 사용되어 왔다.MNase 소화는 효모(사카로미세스 세레비시아에) 미토콘드리아[22] DNA뿐만 아니라 아데닌과 티민이 풍부한 [25]영역의 선호 소화를 통해 박테리오파지[23][24] DNA와 같은 염색질이 없는 염기서열을 분석하기 위해 여러 연구에서 추가로 사용되었다.1980년대 초, MNase 소화는 성숙한 SV40,[26] 초파리(Drosophila melanogaster),[27] 효모,[28] 원숭이 [29]등의 염색체에 대한 핵염색체 단계와 관련 DNA를 결정하기 위해 사용되었다.인간의 유전자 발현에 대한 염색질 접근성의 관련성을 연구하기 위해 이 소화를 사용한 최초의 연구는 1985년이었다.본 연구에서 핵산가수분해효소는 염색질 [30]및 핵단백질과의 특정 종양원성 배열의 연관성을 찾기 위해 사용되었다.염기서열이나 배열 정보 없이 뉴클레오좀의 위치를 결정하기 위해 MNase 소화를 이용한 연구는 2000년대 [31]초반까지 계속되었다.

1990년대 후반과 2000년대 초반 전체 게놈 배열이 등장하면서 정제된 DNA 배열을 S. cerevisiae,[32] Caenorhabditis elegans,[33][37] D. melanogaster,[34] Arabidopsis thaliana,[35] Mus musculus,[36] 호모 사피엔스의 진핵 게놈과 비교하는 것이 가능해졌다.MNase 소화는 MNase 내성 뉴클레오솜으로 농축된 DNA 영역을 결정하기 위해 마이크로어레이를 통한 분석과 함께 S. cerevisae의[38] 게놈 전체 뉴클레오솜 점유 연구에 처음 적용되었다.MNase 기반 마이크로어레이 분석은 종종 효모의 게놈[39][40] 전체 척도와 인간의 제한된[41][42] 게놈 영역에서 사용되어 전사 불활성화를 위한 추론으로 사용될 수 있는 뉴클레오솜 위치를 결정했다.

2006년, C. elegans에서 뉴클레오좀의 위치 결정과 DNA 배열 선호도를 조사하기 위해 Next-Generation 염기서열 배열을 MNase 소화와 처음 결합했다.[43]이것은 어떤 유기체에서도 MNase-seq의 첫 사례였다.

MNase 소화가 높은 처리량 배열(Solexa/Illumina)과 결합되어 [2]인간에서 뉴클레오좀의 위치를 게놈 전체 규모로 연구한 것은 2008년 무렵이었다.1년 후, 염색질 면역 침강을 수반하는 마이크로코칼 뉴클레아제 소화를 의미하는 "MNase-Seq"와 "MNase-ChIP"라는 용어가 마침내 만들어졌다.[3]2006년 [44]최초 적용 이후, MNase-seq는 진핵생물의 [6]뉴클레오솜 점유와 후생유전학과 관련된 심층 염기서열 DNA에 이용되어 왔다.2020년 2월 현재, MNase-seq는 염색질의 [45]접근성을 분석하기 위해 여전히 적용되고 있다.

묘사

염색질은 동적이고 DNA에서 뉴클레오좀의 위치는 다양한 전사 인자와 리모델링 복합체의 활성을 통해 변화하며, 이러한 부위의 전사 활성을 대략 반영합니다.뉴클레오솜으로 둘러싸인 DNA는 일반적으로 [46]전사인자에 접근할 수 없다.따라서 MNase-seq는 어떤 영역이 뉴클레오솜에 [6]결합되어 있는지를 직접 판단함으로써 DNA의 어떤 영역이 전사적으로 접근 불가능한지를 간접적으로 판단하기 위해 사용될 수 있다.

전형적인 MNase-seq 실험에서 진핵세포핵은 우선 관심 조직에서 분리된다.다음으로 MNase-seq는 엔도핵산가수분해효소 마이크로코칼 뉴클레아제를 사용하여 진핵생물 크로마틴 DNA의 단백질 비결합 영역을 결합 및 절단하고, 먼저 한 가닥을 절단하고, 그 후 역핵산가수분해효소도 [3]절단한다.염색질은 선택적으로 포름알데히드와 [47]가교될 수 있다.MNase는 보통 최종 농도가 1mM인 [6][13]Ca를 보조 인자로 필요로2+ 한다.DNA의 영역이 뉴클레오솜 코어(히스톤) 또는 다른 염색질 결합 단백질(전사인자)에 의해 결합되면 MNase는 DNA를 결합 및 절단할 수 없다.시료에서 뉴클레오솜 또는 DNA-단백질 복합체를 정제할 수 있으며, 이후 결합 DNA를 겔 전기영동 및 추출에 의해 정제할 수 있다.정제된 DNA는 일반적으로 [2]뉴클레오솜에서 정제된 경우 150bp, 다른 단백질에서 정제된 경우 더 짧다(예: 전사 인자).[48]이 때문에, 이러한 테크놀로지의 판독치는 매우 정확하지만,[49] 길이가 연속하는 베이스 페어는 수백 개 밖에 커버할 수 없기 때문에, 짧은 판독, 높은 스루풋의 시퀀싱이 MNase-seq 에 최적입니다.염기서열이 확인되면 Bowtie와 [4]같은 도구를 사용하여 어떤 DNA 영역이 뉴클레오솜이나 단백질에 의해 결합되는지를 결정하기 위해 참조 게놈에 맞춰질 수 있습니다.MNase-seq를 통해 밝혀진 뉴클레오솜의 위치는 소화 시 게놈 발현과[50] 조절을[51] 예측하는 데 사용될 수 있다.

확장 기술

시퀀싱에 대한 MNase의 기술적 응용

MNase-ChIP/CUT&RUN 시퀀스 처리

최근에는 전사 인자가 [52][53]DNA와 결합하는 위치를 결정하는 데에도 MNase-seq가 구현되고 있다.Classic ChIP-seq는 분해능 품질, 실험 프로토콜의 문자열성 및 DNA [53]조각화에 관한 문제를 표시합니다.고전적인 ChIP-seq는 일반적으로 음파를 사용하여 염색질을 단편화하며, 염색질 영역은 서로 [53]응축되고 밀접하게 결합하기 때문에 이색 영역을 편향시킨다.히스톤과 달리, 전사 인자는 DNA를 일시적으로 결합할 뿐이다.ChIP-seq에서의 초음파 처리와 같이 온도와 세제를 증가시켜야 하는 다른 방법은 인자의 손실을 초래할 수 있습니다.CUT&RUN 시퀀싱은 MNase 기반의 새로운 형태의 면역 침강이다.간단히 말해서, 항체가 인식되는 에피토프를 나타내는 DNA 결합 단백질을 특이적으로 결합하기 위해 항체가 태그된 MNase를 사용한다.그리고 나서 소화는 특히 전사 인자를 둘러싼 영역에서 일어나며, 이 복합체가 핵 밖으로 확산되어 상당한 배경이나 초음파 작용의 합병증에 대해 걱정할 필요 없이 얻어질 수 있게 한다.이 기술을 사용하려면 고온 또는 고농도의 세제가 필요하지 않습니다.또한 MNase는 엑소핵산가수분해효소 및 엔도핵산가수분해효소 활성에 의해 크로마틴 소화를 개선한다.셀은 SDS/Tridon X-100 용액으로 용해됩니다.다음으로 MNase-항체복합체가 추가된다.마지막으로 단백질-DNA 복합체를 분리하여 DNA를 정제 및 배열할 수 있다.그 결과 용해성 추출물은 50bp 미만의 조각에 25배의 농축물을 함유하고 있다.이렇게 농축이 증가하면 비용 효율적인 고해상도 [53]데이터가 생성됩니다.

싱글셀 MNase-seq

단세포 마이크로코칼 뉴클레아제 배열결정(scMNase-seq)은 단세포 [54]입력만을 사용하여 뉴클레오좀의 위치를 분석하고 염색질 접근성을 추론하기 위해 사용되는 새로운 기술이다.첫째, 형광활성화세포분류(FACS)[54]를 사용하여 세포를 단일 알쿼트로 분류한다.그리고 나서 세포는 마이크로콕칼 뉴클레아제(nuclease)로 용해되고 소화된다.분리된 DNA는 PCR 증폭된 후 원하는 염기서열을 분리하여 [54]분석합니다.단세포 분석에서 MNase를 사용하면 DNase I 과민성 부위 및 전사 인자 결합 [54]부위의 검출이 증가한다.

다른 Chromatin 접근성 평가와의 비교

Sequencing table.png

MNase-seq는 염색질 접근성 및 [55]유전자 발현에 대한 후속 결과를 보다 직접적으로 결정하기 위한 4가지 주요 방법 중 하나이다(DNAase-seq, MNAase-seq, FAIR-seq 및 ATAC-seq.네 가지 기술 모두 ChIP-seq와 대조되는데, ChIP-seq는 히스톤 꼬리의 특정 표시가 유전자 활성화 또는 [56]억제를 나타내며, 뉴클레오좀의 위치를 직접 평가하는 것이 아니라 히스톤 수식 효소 [4]기능의 평가에 가치가 있다는 추론에 의존한다.

DNase-seq

DNase-seq는 [2]MNase-seq와 마찬가지로 기존 DNA 엔도핵산가수분해효소[7](Endonuclease)와 Next-Generation Sequencing 기술을 결합하여 크로마틴 접근성을 [57]측정하여 개발되었습니다.두 기술 모두 각각의[4] 유기체에서 뉴클레오솜의 위치에 대한 정보를 확인하기 위해 여러 진핵생물에 걸쳐 사용되었으며, 둘 다 개방 DNA를 소화하는 동일한 원리에 의존하여 뉴클레오솜[2][58] 또는 전사 인자 [48][58]정보를 확인할 경우 더 짧은 대역에서 DNA의 최대 140bp 밴드를 분리한다.두 기술 모두 최근 단일 셀 시퀀싱에 최적화되었으며, 이는 두 기술의 주요 단점 중 하나인 [59][54]높은 셀 입력에 대한 요구사항을 수정합니다.

충분한 농도에서 DNase I은 뉴클레오솜 결합 DNA를 10bp로 소화할 수 있는 반면, 마이크로콕칼 뉴클레아제는 [18]소화할 수 없다.또한 DNase-seq는 DNase 처리에 과민한 DNA 영역이며 종종 조절 영역(예: 촉진제 또는 강화제)[60]을 나타내는 DHS를 식별하는 데 사용된다.MNase에서는 동등한 효과를 찾을 수 없습니다.이 구별의 결과로 DNase-seq는 주로 조절 영역을 직접 식별하기 위해 이용되는 반면, MNase-seq는 유전자 [4]발현에 대한 영향을 간접적으로 추론하기 위해 전사 인자와 핵염색체 점유를 식별하기 위해 사용된다.

페어세크

FAIR-seq는 DNase-seq보다 MNase-seq와 [4]더 많이 다릅니다.FAIR-seq는 2007년에[8] 개발되어 3년 후 DHS를 [61]연구하기 위해 차세대 염기서열과 결합되었다. FAIR-seq는 포름알데히드를 사용하여 표적 단백질과 DNA를 가교한 후 후속 소닌화와 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 비가교 DNA와 가교 DNA를 분리한다.비교차 DNA를 배열 및 분석하여 개방 크로마틴을 [62]직접 관찰할 수 있습니다.

MNase-seq는 FAIR-seq만큼 직접적으로 크로마틴 접근성을 측정하지 않는다.그러나 FAIER-seq와 달리 반드시 [6]가교할 필요는 없으며 [4]초음파에도 의존하지 않지만 페놀과 클로로포름 [6]추출이 필요할 수 있다.FAIR-seq의 두 가지 주요 단점은 다른 세 가지 클래스와 비교하여 100,000 셀의 최소 필요 입력과 가교 [8]의존이다.가교 작용은 DNA와 일시적으로 상호작용하는 다른 염색질 결합 단백질과 결합할 수 있으며, 따라서 수상에서 [55]회복되고 측정될 수 있는 비가교 DNA의 양을 제한할 수 있다.따라서 FAIR-seq에서 얻은 전체 분해능은 DNase-seq 또는 MNase-seq의[55] 분해능보다 상대적으로 낮을 수 있으며,[8] DNase-seq[59] 또는 MNase-seq의[54] 단세포 등가물은 이들을 훨씬 더 매력적인 [4]대안으로 만든다.

ATAC-seq

ATAC-seq는 염색질 접근성 분석의 가장 [9]최근 개발된 클래스입니다.ATAC-seq는 염기서열을 위해 프라이머를 결합할 수 있는 특정 어댑터를 가진 트랜스포저블 마커를 염색질의 열린 영역에 삽입하기 위해 초활성 트랜스포저 효소를 사용한다.PCR은 삽입된 트랜스포존에 인접한 배열을 증폭하기 위해 사용될 수 있으며, 이로 인해 크로마틴 [9][10]구조의 변화를 일으키지 않고 개방 크로마틴 배열을 결정할 수 있다.ATAC-seq는 냉동 샘플을 [63]포함한 다른 진핵 생물들 중에서 사람에게 효과가 있는 것으로 입증되었습니다.DNase-seq[59] [54]및 MNase-seq와 마찬가지로 ATAC-seq의 성공적인 단일 셀 버전도 [64]개발되었습니다.

ATAC-seq는 크로마틴 접근성을 평가하는 데 있어 MNase-seq보다 몇 가지 이점이 있다.ATAC-seq는 마이크로코칼 핵산가수분해효소의 가변 소화, 가교 또는 페놀-클로로포름 [6][10]추출에 의존하지 않는다.일반적으로 염색질 구조를 유지하므로, ATAC-seq의 결과는 MNase-seq를 통해 간접적으로가 아니라 직접 염색질 접근성을 평가하는 데 사용될 수 있다.ATAC-seq도 [10]몇 시간 이내에 완료할 수 있지만, 다른 세 가지 기법에는 일반적으로 하룻밤의 [6][7][8]잠복기가 필요하다.ATAC-seq의 두 가지 주요 단점은 MNase-seq에 비해 높은 염기서열 범위 요건과 미토콘드리아 DNA와 핵 [9][10]DNA에 비특이적 DNA 삽입으로 인한 미토콘드리아 오염의 확산이다.이러한 사소한 단점에도 불구하고 대체 수단보다 ATAC-seq의 사용이 더욱 [4]보편화되고 있습니다.

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