단백질 마이크로어레이

Protein microarray

단백질 마이크로어레이(또는 단백질 칩)는 단백질의 상호작용과 활동을 추적하고 그 기능을 결정하고 기능을 대규모로 [1]결정하는 데 사용되는 높은 처리량 방법이다.이것의 주된 장점은 많은 양의 단백질을 병렬로 추적할 수 있다는 사실에 있다.칩은 유리 슬라이드, 니트로셀룰로오스막, 비드 또는 마이크로타이틀 플레이트와 같은 지지 표면으로 구성되어 있으며, 여기에는 포획 단백질 배열이 [2]결합되어 있습니다.일반적으로 형광 염료로 라벨이 부착된 프로브 분자가 어레이에 추가됩니다.프로브와 고정 단백질 사이의 모든 반응은 레이저 [3]스캐너로 판독되는 형광 신호를 방출합니다.단백질 마이크로어레이는 빠르고 자동화되며 경제적이며 매우 민감하여 소량의 검체 및 [4]시약을 소비합니다.단백질 마이크로어레이의 개념과 방법론은 1983년 항체 마이크로어레이(항체 매트릭스라고도 함)에서 과학 출판물과[5] 일련의 [6]특허에서 처음 소개되고 설명되었습니다.단백질 마이크로어레이의 배후에 있는 높은 처리량 기술은 가장 널리 사용되는 마이크로어레이가 [7]된 DNA 마이크로어레이를 위해 개발된 기술을 기반으로 하기 때문에 상대적으로 개발하기가 쉬웠다.

개발 동기

단백질 마이크로어레이는 단백질체학에서 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 DNA 마이크로어레이를 사용하는 한계 때문에 개발되었습니다.세포 내의 mRNA의 양은 종종 그들이 대응하는 단백질의 발현 수준을 반영하지 않는다.세포 반응에서 기능적 역할을 하는 것은 보통 mRNA가 아닌 단백질이기 때문에, 새로운 접근이 필요했다.또한 단백질 기능을 결정하는 데 중요한 번역 후 수정은 DNA 마이크로어레이에서는 [8]보이지 않습니다.단백질 마이크로어레이는 2D 겔 전기영동 또는 크로마토그래피와 같은 전통적인 단백질학 기술을 대체하는데, 이는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 저농축 단백질 분석에 적합하지 않습니다.

어레이 작성

단백질은 현미경 슬라이드, 막, 비즈 또는 마이크로타이틀 플레이트와 같은 단단한 표면에 배열됩니다.이 표면의 기능은 단백질이 고정될 수 있는 지지대를 제공하는 것입니다.단백질은 결합 능력이 유지되도록 토종 배열을 유지하면서 최대 결합 특성을 보여야 한다.유리나 실리콘으로 만든 현미경 슬라이드는 DNA 마이크로어레이 기술을 위해 개발된 쉽게 구할 수 있는 로봇 어레이와 레이저 스캐너와 호환되기 때문에 인기 있는 선택이다.니트로셀룰로오스 필름 슬라이드는 단백질 마이크로어레이 응용을 위한 가장 높은 단백질 결합 기질로 널리 받아들여지고 있다.

선택한 고체 표면은 단백질 고정, 변성 방지, 결합 부위에 접근할 수 있도록 적절한 방향으로 방향 설정 및 결합 반응이 발생할 수 있는 친수성 환경을 제공하는 동시 기능을 수행해야 하는 코팅으로 덮여 있습니다.또한 검출 시스템의 백그라운드 노이즈를 최소화하기 위해 비특정 바인딩을 최소한으로 표시해야 합니다.또한 다른 탐지 시스템과 호환되어야 합니다.고정제로는 알루미늄 또는 금층, 친수성 고분자 및 폴리아크릴아미드겔 층 또는 아민, 알데히드 또는 에폭시 처리를 포함한다.물리증기증착(PVD) 및 화학증기증착(CVD)과 같은 박막 기술이 서포트 표면에 코팅에 사용됩니다.

단백질 변성을 방지하기 위해 어레이 제조 및 운영의 모든 단계에서 수성 환경이 필수적입니다.따라서 시료 버퍼에는 글리세롤 함량이 높고(응고점을 낮추기 위해) 제조환경의 습도를 주의 깊게 조절한다.마이크로웰은 시료 간의 교차 오염을 방지하면서 수성 환경을 제공할 수 있는 두 가지 이점을 가지고 있습니다.

가장 일반적인 유형의 단백질 배열에서 로봇은 미리 정의된 패턴으로 코팅된 고체 지지대 위에 많은 단백질 또는 그 배위자를 놓습니다.이를 로봇 접점 인쇄 또는 로봇 스팟팅이라고 합니다.또 다른 제조방법은 원하는 패턴으로 단백질 폴리머를 고체표면에 [9]분산시키는 온디맨드 비접촉 방식인 잉크젯이다.압전 스폿은 잉크젯 인쇄와 유사한 방법입니다.인자 헤드는 어레이를 가로질러 이동하며, 각 지점에서 전기 자극을 사용하여 작은 제트를 통해 단백질 분자를 표면으로 전달합니다.이것도 비접촉 [10]프로세스입니다.포토리소그래피는 표면에 단백질을 배열하는 네 번째 방법이다.빛은 포토마스크, 구멍이 있는 불투명한 판 또는 정의된 패턴으로 빛을 투과할 수 있는 투명판과 함께 사용됩니다.그런 다음 일련의 화학 처리를 통해 원하는 패턴의 단백질을 포토마스크 [11]아래 물질에 부착할 수 있다.

고체 표면에 배열된 포획 분자는 항체, 항원, 압타머(핵산 기반 리간드), 아피바디(단일클로널 항체를 모방하도록 설계된 작은 분자) 또는 전장 단백질일 수 있다.이러한 단백질의 공급원에는 재조합단백질을 위한 세포기반 발현시스템, 자연원으로부터의 정제, 세포없는 번역시스템에 의한 시험관내 생산 및 펩타이드의 합성방법이 포함된다.이러한 방법의 대부분은 높은 throughput 생산을 위해 자동화할 수 있지만, 단백질 변성 또는 추출 조건을 피하기 위해 주의해야 합니다.변성 단백질은 결합 파트너를 인식하지 못하기 때문에 어레이를 사용할 수 없게 됩니다.

단백질은 미세 환경의 변화에 매우 민감하다.이것은 장기간에 걸쳐 단백질 배열을 안정된 상태로 유지하는 데 어려움을 준다.2001년[12][13] Mingyue He와 Michael Taussig에 의해 발명되어 발표된 현장 방법은 세포 없는 단백질 발현 시스템을 사용하여 DNA에서 직접 필요한 단백질의 온칩 합성을 포함한다.DNA는 매우 안정적인 분자이기 때문에 시간이 지나도 변질되지 않기 때문에 장기 보존에 적합합니다.이 접근법은 또한 단백질은 칩 표면에서 한 단계에서 동시에 만들어지고 고정되기 때문에 별도의 단백질 정제 및 DNA 복제의 수고롭고 종종 비용이 많이 드는 과정을 회피한다는 점에서 유리하다.현장기술의 예로는 PISA(단백질 in situ 배열), NAPPA(핵산 프로그래머블 단백질 배열) 및 DAPA(DNA 배열 대 단백질 배열)가 있다.

어레이의 종류

단백질 어레이의 종류

단백질의 생화학적 활동을 연구하기 위해 현재 사용되는 세 가지 종류의 단백질 마이크로어레이가 있습니다.

분석 마이크로어레이는 캡처 어레이라고도 합니다.본 기술에서는 지지면에 항체, 압타머 또는 어피체의 라이브러리가 배열되어 있습니다.이것들은 각각이 특정 단백질에 특이적으로 결합하기 때문에 포획 분자로 사용된다.어레이는 세포 용해액과 같은 복잡한 단백질 용액으로 검사됩니다.다양한 검출 시스템을 사용하여 결과 결합 반응을 분석하면 결합 친화도 및 특이성의 측정뿐만 아니라 샘플 내 특정 단백질의 발현 수준에 대한 정보를 제공할 수 있다.이러한 유형의 마이크로 어레이는 다른 용액에서 단백질 발현을 비교할 때 특히 유용합니다.예를 들어 특정 인자에 대한 세포의 응답은 특정 물질로 처리되거나 특정 조건에서 성장한 세포의 용액을 제어세포의 용출액과 비교하여 식별할 수 있다.또 다른 적용은 질병 조직의 식별과 프로파일링에 있다.

역상 단백질 마이크로 어레이(RPPA)는 조직 용해액과 같은 복잡한 검체를 포함한다.세포는 다양한 관심 조직으로부터 분리되고 용해된다.리세이트는 마이크로 어레이에 배열되고 대상 단백질에 대한 항체로 프로빙됩니다.이러한 항체는 일반적으로 화학 발광, 형광 또는 측색 분석으로 검출됩니다.기준 펩타이드가 슬라이드에 인쇄되어 샘플 용해물의 단백질 정량화를 가능하게 합니다.RPA는 질병의 결과일 수 있는 변화된 단백질이나 다른 약물의 존재를 결정할 수 있게 해준다.구체적으로는 RPAs를 [14]사용하여 일반적으로 질병의 결과로 변경되는 번역 후 변형을 검출할 수 있다.

기능성 단백질 마이크로어레이

기능성 단백질 마이크로어레이(타겟 단백질 어레이라고도 함)는 많은 정제 단백질을 고정시켜 구성되며 단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단백질-단DNA, 단백질-RNA, 단백질-인지질 및 단백질-소분자 상호작용을 분석하여 항체를 검출하고 특이성을 입증합니다.기능성 단백질 배열은 전장 기능성 단백질 또는 단백질 도메인을 포함하는 배열로 구성된다는 점에서 분석 배열과 다르다.이 단백질 칩들은 한 번의 실험에서 전체 프로테옴의 생화학적 활동을 연구하는데 사용된다.

기능성 단백질 마이크로어레이 기반 분석의 핵심 요소는 배열된 단백질이 배열 표면에서 의미 있는 기능적 상호작용이 일어날 수 있도록 고유한 구조를 유지해야 한다는 것입니다.적절한 친화력 태그를 사용하여 표면 부착의 정확한 모드를 제어하는 장점은 고정화된 단백질이 균질한 배향을 가지며, 결과적으로 비특이적 [15][16]상호작용의 간섭이 적고, 측정에서 더 높은 특이적 활성과 높은 신호 대 잡음 비를 발생시킨다는 것이다.

검출

단백질 배열 검출 방법은 높은 신호와 낮은 배경을 제공해야 합니다.가장 일반적으로 널리 사용되는 검출 방법은 형광 라벨링으로, 매우 민감하고 안전하며 쉽게 구할 수 있는 마이크로 어레이 레이저 스캐너와 호환됩니다.친화력, 광화학 또는 방사성 동위원소 태그와 같은 다른 라벨을 사용할 수 있다.이러한 라벨은 프로브 자체에 부착되어 프로브-표적 단백질 반응을 방해할 수 있습니다.따라서 표면 플라즈몬 공명(SPR), 카본 나노튜브, 카본 나노와이어 센서(컨덕턴스 변화를 통해 검출) 및 마이크로 전기 전자 시스템(MEMS) 캔틸레버 [17]등 다양한 라벨이 없는 검출 방법을 이용할 수 있습니다.이러한 라벨 프리 검출 방법은 모두 비교적 새로운 것으로 아직 높은 처리량 단백질 상호작용 검출에는 적합하지 않지만, 장래에는 많은 가능성을 제공합니다.티올렌의 "합성 종이" 마이크로밀러 발판에 대한 면역측정법은 우수한 형광 [18]신호를 생성하는 것으로 나타났다.

니트로셀룰로오스 코팅 유리 슬라이드의 단백질 정량에서는 근적외선 형광 검출을 사용할 수 있습니다.이것은 표준 형광 검출 [19]프로브에 사용되는 UV 파장에서 니트로셀룰로오스의 자동 형광에 의한 간섭을 제한한다.

적용들

단백질 배열이 적용되는 분야는 진단, 단백질학, 단백질 기능 분석, 항체 특성 분석, 치료제 개발 등 5가지입니다.

진단은 혈액 샘플의 항원과 항체의 검출, 새로운 질병 바이오마커를 발견하기 위한 혈청 프로파일링, 개인화된 의약품의 질병 상태와 치료에 대한 반응 모니터링, 환경과 음식의 모니터링과 관련이 있습니다.디지털 바이오아세이는 진단 목적으로 단백질 마이크로어레이를 사용하는 예입니다.이 기술에서는 유리/폴리머 칩 상의 마이크로웰 배열에 자성 비즈(형광 태그 부착 항체로 코팅됨)를 시드하고 표적 항원을 적용한 후 형광웰 계수기를 통해 현미경으로 특징지어진다.이러한 마이크로웰 어레이를 위한 비용 효율적인 제작 플랫폼(OTE 폴리머 사용)이 최근 입증되었으며 바이오 어세이 모델 시스템이 성공적으로 [20]특성화되었습니다.

프로테오믹스는 단백질 발현 프로파일링, 즉 특정 세포의 용해액에서 단백질이 발현되는 것과 관련이 있다.

단백질 기능 분석은 단백질-단백질 상호작용(예: 단백질 복합체 구성원의 식별), 단백질-인지질 상호작용, 작은 분자 표적, 효소 기질(특히 키나아제 기질) 및 수용체 배위자의 식별이다.

항체 특성은 교차 반응성, 특이성 및 매핑 에피토프를 특징짓는 것입니다.

치료제 개발은 자가면역, 암 및 알레르기에 대한 항원 특이 치료법의 개발을 포함한다. 즉, 신약으로 사용될 수 있는 작은 분자 표적의 식별이다.

과제들

몇몇 회사들이 상당한 투자를 했음에도 불구하고, 단백질 칩은 아직 시장에 넘쳐나지 않았다.제조사들은 단백질이 실제로 다루기 어렵다는 것을 알아냈다.올바르게 접혀 기능하는 신뢰성이 높고 일관성 있는 고처리량 단백질의 생산은 종종 용해도 감소와 포접체 [citation needed]형성으로 인해 단백질의 저수율을 초래하기 때문에 어려움을 겪는다.단백질 칩은 DNA 칩보다 훨씬 더 많은 단계를 필요로 한다.

단백질이 비특이적이고 제대로 정의되지 않은 상호작용 또는 알려진 특정 상호작용 세트를 통해 고정되는지에 따라 근본적으로 다른 이 문제에 대한 많은 접근법이 있다.전자의 접근방식은 단순성이 매력적이며, 토종 또는 재조합[21][22] 소스에서 파생된 정제 단백질과 호환되지만 많은 위험을 겪는다.이들 중 가장 주목할 만한 것은 각 단백질과 표면 사이의 상호작용의 통제되지 않은 본질과 관련이 있다. 기껏해야 이것은 활성 부위가 표면에 의해 때때로 차단되는 단백질의 이종 집단을 야기할 수 있다; 최악의 경우, 부분적 또는 완전한 표면 매개 전개로 인해 활동을 완전히 파괴할 수 있다.고정화된 단백질의 섭취.

과제에는 1) 단백질이 2차 또는 3차 구조를 유지할 수 있도록 하는 표면과 부착 방법을 찾는 것, 즉 생물학적 활성과 다른 분자와의 상호작용, 2) 칩 상의 단백질이 단시간에 변성하지 않도록 긴 저장 수명을 가진 어레이를 생성하는 것, 3) 식별 방법이 포함됩니다.인간 게놈의 모든 단백질에 대한 항체 또는 기타 포획 분자의 분리, 4) 감도를 보장하면서 결합 단백질의 수준을 정량화하고 배경 소음을 피함, 5) 검출된 단백질을 더 분석하기 위해 칩에서 추출함, 6) 포획제에 의한 비특이적 결합 감소, 7) 용량가능한 한 프로테옴의 완전한 표현을 가능하게 하기에 충분한 칩이 있어야 한다; 풍부한 단백질은 일반적으로 더 치료적인 [23]관심이 있는 신호 분자와 수용체와 같은 덜 풍부한 단백질의 검출을 압도한다.

「 」를 참조해 주세요.

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