ScGET-seq

단세포 게놈 및 후생유전체 배열법(scGET-seq)은 개방 및 폐쇄 크로마틴 프로파일링을 위한 DNA 배열법이다.활성 에크로마틴만을 대상으로 하는 트랜스포지아제 접근성 크로마틴에 ^[1]대한 단세포 분석(scATAC-seq)과는 대조적으로 scGET-seq는 비활성 헤테로크로마틴을 ^[2]프로빙할 수도 있다.

이는 헤테로크로마틴 단백질-1-alpha($\displaystyle\alpha$ $\})$의 크로모도메인(CD)을 Tn5 트랜스포사제(Tn5 transposase)에 연결하여 생성되는 TnH를 사용하여 달성된다.다음으로 TnH는 헤테로크로마틴의 ^[3]마커인 히스톤3 리신9 트리메틸화(H3K9me3)를 표적으로 할 수 있다.

Akin이 RNA속도로 TnH의 Tn5 신호 scGET-seq로부터 얻은 그 비율은 휴대에 걸쳐 염색질의 접근성의 역학을 측정하는 염색질 속도, 계산에 이용할 수 있development,[4]에 걸쳐 유전자 발현 변화의 동특성 추론하기spliced의 접속점 없는 RNA의 비율을 사용한다.드개발 ^[2]경로

역사

전사 조절은 염색질 상태와 밀접하게 연관되어 있다.개방적이거나 전사에 허용되는 염색질은 게놈의 2~3%에 불과하지만 전사인자 결합 ^[5][6]부위의 94.4%를 차지한다.반대로, 더 촘촘하게 채워진 DNA, 즉 헤테로크로마틴은 게놈 구성과 ^[7]안정성에 책임이 있다.염색질 밀도도 세포 분화 ^[8]과정에 따라 변화하지만 헤테로크로마틴을 직접 측정하기 위한 높은 처리량 배열 방법은 부족하다.

암과 같은 많은 유전체 관련 질병들은 후생유전자의 변화와 매우 관련이 있다.특히 암은 전이 및 치료 내성을 촉진할 ^[9][10]수 있는 단세포 이질성을 특징으로 한다.단세포 후생유전학을 포함한 단세포 기술의 출현은 그들의 ^[11]해명에 크게 기여했지만, 이러한 과정의 기초가 되는 메커니즘은 여전히 거의 알려져 있지 않다.

2015년에, ATAC-seq는 조각과 태그 접근할 수 있는 염색질 또는 진정 염색질에 순서의 Tn5 transposase이 단세포와 해상도에서 실행 가능하게 되었다.[12]scGET-seq 이 기술로 또한, 각각의 세포 내에 염색질 구조와 역동성을 좀 더 종합적인 표정을 제공하는 이질 염색질에서 정보를 제공하여 만드는 것이다.[13]

방법들

샘플 준비

scGET-seq용 시료제제는 시작 재료에 ^[14]적합한 방법을 사용하여 세포에서 핵의 현탁액을 얻는 것으로 시작한다.

다음 단계는 TnH 트랜스포즈 효소를 생성하는 것입니다.Tn5는 뉴클레오솜(개방 크로마틴)^[15]에 의해 결합되는 게놈 영역에 어댑터를 절단하고 결합하는 트랜스포지아제이다.HP-1a는 HP1 패밀리의 일종으로 H3K9me3를 ^[16][17]인식하고 특정 결합할 수 있습니다.이 염색질 변형을 ^[18]인식하기 위해 유도적합기구를 사용한다.3개의 폴리티로신글리신세린(TGS) 링커를 사용하여 크로모도메인을 포함한 HP-1a의 최초 112개의 아미노산을 Tn5에 결합하면 H3K9me3으로 ^[2]표시된 헤테로크로마틴을 표적으로 하는 TnH 트랜스포사아제 생성으로 이어진다.

라이브러리 준비는 단세포 ATAC-seq에 ^[19]대해 수정된 프로토콜을 사용하여 이루어지며, 여기서 핵 현탁액은 먼저 Tn5 트랜스포즈 효소로 순차적으로 배양되고, 그 후 TnH로 ^[2]배양된다.

데이터 분석

데이터 분석의 목표는 다음과 같습니다.^[2]

1. 군집 분석을 사용하여 개별 셀 모집단을 식별하고 특성화하는 방법
2. 게놈 전체에서 염색질 접근성을 프로파일링하려면
3. 복사 번호 변형 및 단일 핵산 변형을 예측하는 방법

전처리

1. 시퀀싱 후 판독치를 분단하여 적절한 참조 게놈에 매핑해야 합니다.중복된 읽기가 식별되어 삭제됩니다.
2. "피크" 즉, 매핑된 판독 수로 농축된 DNA의 영역이 ^[20]식별됩니다.
3. 품질관리를 실시하여 읽기 횟수가 적거나 검출된 특징이 적은 셀을 필터링한다.
4. 4개의 카운트 행렬(각 열이 셀이고 각 행이 피쳐인 행렬)이 생성됩니다.Tn5-dhs, Tn5-completment, TnH-dhs 및 TnH-completment.^[2] 접근성 및 압축된 크로마틴으로부터의 신호를 나타낸다.

분석.

치수 축소, 시각화 및 클러스터링

각 행렬은 공유 영역을 필터링한 후 정규화하고 log2를 변환합니다.선형 치수 감소는 주성분 분석(PCA)을 사용하여 수행됩니다.셀 그룹은 k-NN^[21] 알고리즘과 라이덴 ^[22]알고리즘을 사용하여 식별됩니다.마지막으로 행렬 인수분해^[23] 및 UMAP ^[24]축소를 사용하여 4개의 행렬을 결합한다.

셀 식별 주석

셀 아이덴티티 주석에는 다음 두 가지 방법이 있습니다.ATAC ^[25]피크의 특징 주석을 기반으로 한 주석 및 참조 scRNA-seq ^[26]데이터와의 통합을 기반으로 한 주석.

적용들

현재의

Tn5 대 TnH 신호의 비율을 이용하여 염색질 재모델링이 얼마나 빠르고 어떤 방향으로 이루어지고 있는지를 나타내는 정량값(크로마틴 속도)^[2]을 산출할 수 있다.가장 동적인 영역을 분리하여 어떤 전사인자가 결합하는지를 식별함으로써 염색질 속도는 주어진 세포 내에서 일어나는 동적인 후생유전 과정과 그 ^[2]과정에 대한 다양한 전사인자의 기여를 추론하기 위해 사용될 수 있다.

미래.

염색질 재모델링은 유전자 발현 변화에 앞서 세포 ^[27][28]변화의 궤적과 메커니즘에 대한 이해를 증진시킨다.따라서, 멀티모달 데이터의 통합을 위한 플랫폼과 도구는 활발한^[29][30][31] 연구 영역이다. 크로마틴 속도와 RNA 속도의 통합을 통해 시간적 및 방향성 요소를 통합하는 것은 분화 ^[32][33]경로에 대한 더 많은 정보를 밝히기 위해 제안되었다.

제한 사항

scGET-seq에는 scATAC-seq와 같은 제한이 있습니다.두 과정 모두 생존 가능한 세포의 핵 샘플과 높은 세포 ^[34]생존 능력을 필요로 합니다.낮은 세포 생존력은 정확한 생물학적 신호를 나타내지 못하는 높은 백그라운드 DNA 오염으로 이어집니다.또한 scATAC-seq 및 scGET-seq 데이터의 희소성과 노이즈 특성으로 인해 분석이 어려우며 이 데이터를^[35] 가장 잘 관리하는 방법에 대한 합의가 아직 이루어지지 않았습니다.

또 다른 한계는 scGET-seq가 여전히 벌크 게놈 시퀀싱에 의한 SNV 결과 검증이 필요하다는 것이다.벌크 엑솜 시퀀싱과 scGET-seq 결과 사이에 높은 상관관계가 있지만 scGET-seq는 모든 엑솜 SNV를 캡처하는 ^[2]데 실패합니다.

레퍼런스