아황산수소염 배열법

Bisulfite sequencing
그림 1: 게놈 DNA 시료 배열의 아황산수소 변환 개요파란색 중 뉴클레오티드는 비황산염에 의해 유라실로 변환된 비메틸화 사이토신이며, 빨간색 뉴클레오티드는 변환에 내성이 있는 5-메틸사이토신이다.
그림 2: 시토신에서 유라실로의 중황산염 촉매 변환의 기초가 되는 화학 반응의 개요.

비술파이트[1] 염기서열처리(Bisulphite Sequencing)는 메틸화 패턴을 결정하기 위해 정기적인 염기서열처리 전에 DNA의 비술파이트 처리를 사용하는 것입니다.DNA 메틸화는 최초로 발견된 후생유전학적 표시이며 가장 많이 연구되고 있다.동물에서는 주로 디뉴클레오티드 CpG의 시토신 잔기의 탄소-5 위치에 메틸기를 첨가하는 것을 포함하며, 전사 활성 억제에 관여한다.

DNA를 중황산염으로 처리하면 시토신 잔기가 우라실로 전환되지만 5-메틸시토신 잔기는 영향을 받지 않는다.따라서, 중황산염으로 처리된 DNA는 메틸화된 세포신만을 보유한다.따라서, 중황산염 처리는 개별 시토신 잔기의 메틸화 상태에 따라 달라지는 DNA 배열의 특정 변화를 유발하여 DNA 세그먼트의 메틸화 상태에 대한 단일 핵산 분해능 정보를 생성한다.변경된 시퀀스에 대해 다양한 분석을 수행하여 이 정보를 검색할 수 있습니다.따라서 이 분석의 목적은 중황산염 전환에 따른 단일 뉴클레오티드 다형(시토신 및 티미딘)을 구별하는 데 있다(그림 1).

방법들

아황산염 염기서열처리는 아황산염 처리된 게놈 DNA에 통상적인 염기서열방법을 적용하여 CpG 다이뉴클레오티드에서의 메틸화 상태를 판정한다.특정 위치 또는 게놈 전체 수준에서 메틸화를 조사하기 위해 다른 비순서화 전략도 사용된다.모든 전략은 비황산염 유도성 비메틸화 세포신에서 유라실로의 전환이 완료되었으며, 이는 이후의 모든 기술의 기초가 된다고 가정한다.이상적인 방법은 각 대립 유전자에 대해 메틸화 상태를 개별적으로 결정하는 것이다.중황산염 배열의 대체 방법으로는 복합 중황산염 제한 분석 및 메틸화 DNA 면역 침강(MeDIP)이 있다.

아황산염 처리 DNA를 분석하기 위한 방법론이 지속적으로 개발되고 있다.이러한 급속히 진화하는 방법론을 요약하기 위해 수많은 리뷰 기사가 [2][3][4][5]작성되었다.

방법론은 일반적으로 메틸화 특이적 PCR(MSP)에 기초한 전략(그림4)과 비메틸화 특이적 조건에서 수행되는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하는 전략(그림 3)으로 나눌 수 있다.마이크로어레이 기반 방법은 또한 비메틸화 특이적 조건에 기초한 PCR을 사용한다.

비메틸화 특이적 PCR 기반 방법

그림 3: 메틸화 특이 PCR에 기초하지 않은 DNA 메틸화 분석 방법.중황산염 변환 후 메틸화배열과 비메틸화배열을 구별하지 않는 PCR로 게놈 DNA를 증폭한다.그런 다음 사용 가능한 많은 방법을 사용하여 중황산염 변환의 결과로 엠프리콘 내의 변화에 따라 구별합니다.

직접 시퀀스 처리

최초로 보고된 비황산염 처리 DNA를 이용한 메틸화 분석 방법은 PCR과 표준 디옥시뉴클레오티드 DNA 염기서열을 이용하여 비황산염 [6]전환에 저항하는 뉴클레오티드를 직접 결정하였습니다.프라이머는 비황산염 특이적(즉, 비황산염 처리 DNA와 상보적이지 않은 비 CpG 세포신을 포함하는 프라이머)뿐만 아니라 가닥 특이적(sland-specific)이 되도록 설계되어 관심 메틸화 부위의 측면(그러나 관련되지 않음)에 배치된다.따라서 메틸화 특이적 PCR과는 대조적으로 메틸화 및 비메틸화 염기서열을 모두 증폭시킨다.미메틸화 사이토신의 모든 부위는 결과적으로 증폭된 센스 스트랜드의 배열에서 티마인 및 증폭된 안티센스 스트랜드에서 아데닌으로 표시된다.PCR 프라이머에 높은 throughput 시퀀싱 어댑터를 내장함으로써 대규모 병렬 시퀀싱으로 PCR 제품을 시퀀싱할 수 있습니다.또는 노동 집약적으로 PCR 제품을 복제 및 배열할 수 있다.중첩된 PCR 방법을 사용하여 시퀀싱을 위해 제품을 강화할 수 있습니다.

비황산염 처리 DNA를 사용한 이후의 모든 DNA 메틸화 분석 기술은 Frommer 등의 보고서에 기초한다(그림 2).[6]대부분의 다른 양식들은 진정한 배열 기반 기술이 아니지만, "이슬파이트 배열"이라는 용어는 일반적으로 중황산염 변환 DNA 메틸화 분석 기술을 설명하기 위해 종종 사용된다.

파이로시퀀싱

파이로시퀀싱은 메틸화 특이적 PCR을 [7][8]사용하지 않고 중황산염 처리 DNA를 분석하는 데도 사용되어 왔다.관심 영역의 PCR 증폭 후 파이로시퀀싱을 사용하여 해당 영역 내 특정 CpG 부위의 중황산염 변환 배열을 결정한다.개별 부위의 C-t의 비율은 시퀀스 확장 중 C와 T의 혼입 양에 따라 정량적으로 결정할 수 있다.이 방법의 주요 제한은 기술 비용입니다.그러나 파이로시퀀싱은 높은 처리량 스크리닝 방법으로 확장할 수 있습니다.

이 기술에 대한 추가적인 개선은 최근 Wong 등에 의해 설명되었으며, 이는 염기서열 분석 시 단일핵산 다형성을 통합하는 대립 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 모계 및 부계 대립 [9]유전자의 분리 분석을 가능하게 했다.이 기술은 게놈 임프린트 분석에 특히 유용하다.

메틸화 감수성 단일 스트랜드 배좌 분석(MS-SSCA)

이 방법은 단일핵산다형(SNP)[10] 분석을 위해 개발된 단일사슬배향다형분석(SSCA) 방법에 기초한다.SSCA는 크기가 동일하지만 비변성 전기영동에서의 차이 이동에 기초하여 뚜렷한 배열의 단일 가닥 DNA 조각 사이를 구별한다.MS-SSCA에서는 이 방법을 사용하여 관심 CpG 부위가 포함된 중황산염 처리 PCR 증폭 영역을 구별한다.SSCA는 단일 뉴클레오티드 차이만 존재하는 경우 감수성이 부족하지만, 중황산염 처리는 대부분의 관심 영역에서 C-to-T 변환이 빈번히 이루어지며, 그 결과 감수성이 100%에 도달한다.MS-SSCA는 또한 밴드 강도 비율에 기초한 DNA 메틸화 정도에 대한 반정량 분석을 제공한다.단, 이 방법은 개별 메틸화 부위가 아닌 관심 영역의 모든 CpG 부위를 전체적으로 평가하도록 설계되었다.

고해상도 용해 분석(HRM)

변환되지 않은 아황산염 처리 DNA에서 변환된 것을 구별하는 또 다른 방법은 [11]SNP를 구별하기 위해 최초로 설계된 정량 PCR 기반의 기술인 고해상도 용해 분석(HRM)을 사용하는 것이다.PCR 앰플리콘은 온도 상승과 용융 중 중간 형광 염료의 방출에 의해 직접 분석됩니다.엠프리콘의 C-to-T 함량으로 나타나는 메틸화 정도는 용융 속도와 그에 따른 염료 방출 속도를 결정합니다.이 방법은 단일 튜브 분석에서 직접 정량화할 수 있지만 특정 CpG 부위가 아닌 증폭 영역 전체에서 메틸화를 평가합니다.

메틸화 감수성 단일뉴클레오티드 프라이머 익스텐션(MS-SnuPE)

MS-SnuPE는 단핵 다형 [12]분석을 위해 초기에 설계된 프라이머 확장 방법을 사용한다.DNA를 아황산염으로 변환하여 해당 CpG 직전 염기쌍까지 아황산염 특이 프라이머를 아닐한다.프라이머는 디데옥시뉴클레오티드를 종단하는 DNA 중합효소를 사용하여 하나의 염기쌍을 C(또는 T)로 확장할 수 있으며, C 대 T의 비율은 정량적으로 결정된다.

이 C:T 비율을 결정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다.처음에 MS-SnuPE는 프라이머 확장의 리포터로서 방사성 ddNTP에 의존했습니다.형광 기반 방법 또는 파이로시퀀싱도 사용할 [13]수 있습니다.단, 기본적으로 SNP 유전자 타입핑용으로 설계된 GOOD 어세이(GOOD Assay)에 기초하여 두 다형 프라이머 익스텐션 생성물을 구별하기 위한 매트릭스 지원 레이저 탈착/비행 시간 분석(MALDI-TOF)을 사용할 수 있다.프라이머 확장 제품을 [14]구별하기 위해 이온 쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP-RP-HPLC)도 사용되었습니다.

염기 특이적 분할/MALDI-TOF

에리히 등에 의해 최근에 기술된 방법은 뉴클레오티드 [15]변화로부터 얻은 정보를 강화하기 위해 염기 특이적 절단 단계를 추가함으로써 더 나아가 중황산염 변환을 이용한다.우선 관심 영역의 RNA에 대한 시험관내 전사를 사용함으로써(초기 증폭에서 PCR 프라이머에 RNA 중합효소 프로모터 사이트를 추가함으로써) RNase A를 사용하여 염기 특이 부위의 RNA 전사를 절단할 수 있다.RNase A는 시토신 및 우라실 리보뉴클레오티드에서 특이적으로 RNA를 절단하므로 시토신 특이적(C 특이적) 분할이 바람직할 때는 내분할성 dTTP를 삽입하고, 우라실 특이적(U 특이적) 분할이 바람직할 때는 dCTP를 삽입함으로써 염기 특이성을 달성한다.절단된 단편은 MALDI-TOF로 분석할 수 있습니다.아황산수소염 처리는 C-U 변환에 의한 절단 부위의 도입/제거 또는 증폭된 역스트랜드에서의 G-A 변환에 의한 단편 질량의 변화를 초래한다.C 특이적 분할은 메틸화된 모든 CpG 부위에서 특히 감소한다.생성된 단편들의 크기를 분석함으로써 영역 전체의 메틸화 정도를 결정하는 것이 아니라 영역 내 CpG 부위의 DNA 메틸화 특정 패턴을 결정할 수 있다.이 방법은 높은 처리량 스크리닝의 유효성을 입증하여 비용 효율적인 방법으로 여러 조직의 수많은 CpG 부위를 조사할 수 있게 했다.

메틸화 특이 PCR(MSP)

그림 4: 메틸화 특이적 PCR은 아황산염 변환 게놈 DNA에서 메틸화 특이적 프라이머를 사용하여 관심 영역을 구별하여 증폭 및 검출하는 민감한 방법이다.이러한 프라이머는 메틸화된 배열에만 아닐되며, 따라서 중황산염에 의한 변환에 내성이 있는 5-메틸사이토신을 포함한다.또한 비메틸화 특이 프라이머를 사용할 수 있다.

메틸화 분석의 이 대체 방법은 또한 중황산염 처리 DNA를 사용하지만 [16]관심 영역의 염기서열을 지정할 필요는 없다.대신 프라이머 쌍은 변환되지 않은 5-메틸사이토신만을 보완하는 배열을 포함하거나, 반대로 비메틸사이토신에서 변환된 티미인을 보완하는 배열을 포함함으로써 스스로 "메틸화 특이적"이 되도록 설계된다.메틸화는 증폭을 달성하기 위한 특정 프라이머의 능력에 의해 결정된다.이 방법은 프라이머에서 CpG 쌍의 수가 증가하면 분석의 특이성이 증가하므로 메틸화 밀도가 높을 수 있는 CpG 섬을 조사하는 데 특히 유용합니다.CpG 쌍을 프라이머의 3' 끝에 배치하는 것도 감도를 향상시킵니다.MSP를 사용한 초기 보고서는 대립 유전자의 0.1%의 메틸화를 검출하기에 충분한 민감도를 기술했다.일반적으로 MSP 및 관련 프로토콜은 특정 궤적에서 메틸화 상태를 조사할 때 가장 민감한 것으로 간주된다.

MethyLight 방법은 MSP를 기반으로 하지만 정량적 [17]PCR을 사용하여 정량적 분석을 제공합니다.메틸화특이적 프라이머를 사용하고 증폭영역에 아닐하는 메틸화특이적 형광리포터 프로브를 사용한다.다른 방법으로는 관련된 배열 내에서 CpG 쌍 간에 식별이 필요한 경우 메틸화 특이성 없이 프라이머 또는 프로브를 설계할 수 있다.정량화는 메틸화 기준 DNA를 참조하여 이루어진다.성공적으로 중황산염 변환 DNA(ConLight-MSP)를 위한 PCR의 특이성을 높이기 위한 본 프로토콜의 수정은 이 비특이적 [18]증폭을 정량화하기 위해 중황산염 비변환 DNA에 대한 추가 프로브를 사용한다.

MSP 증폭 DNA를 이용한 추가 방법론에서는 용융곡선 분석(Mc-MSP)[19]을 이용하여 제품을 분석한다.이 방법은 메틸화특이적 프라이머와 비메틸화특이적 프라이머를 모두 사용하여 중황산염 변환 DNA를 증폭하고, 용융곡선 분석에서 생성된 차분 피크를 비교하여 두 제품의 정량비를 구한다.특히 저준위 메틸화의[20] 민감한 검출을 위해 정량 PCR과 용해 분석을 모두 사용하는 고해상도 용해 분석 방법이 도입되었습니다.

마이크로 어레이 기반 방식

마이크로어레이 기반 방법은 메틸화의 [21]게놈 전체 분석을 가능하게 하기 위해 중황산염 처리 DNA를 분석하기 위해 사용할 수 있는 기술의 논리적 확장입니다.올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 관심 CpG 부위를 대상으로 한 올리고뉴클레오티드 교배 프로브를 사용하여 설계된다.하나는 변화하지 않은 메틸화 배열을 상보하고, 다른 하나는 C-to-U 변환된 비메틸화 배열을 상보한다.프로브는 또한 아황산염에 의해 불완전하게 변환되는 DNA에 대한 결합을 방지하기 위해 아황산염 특이적이다.Illumina Methylation Assay는 비황산염 염기서열 기술을 마이크로어레이 수준에서 적용하여 게놈 전체의 메틸화 데이터를 생성하는 검사 중 하나입니다.

제한 사항

5-히드록시메틸시토신

비황산염 배열은 포유류의 게놈에서 널리 사용되고 있으나 새로운 포유류의 DNA 변형 5-히드록시메틸시토신이 [22][23]발견됨에 따라 합병증이 발생했다. 5-히드록시메틸시토신은 비황산염 처리 시 시 시토신-5-메틸술폰산염으로 변환되며,[24] 배열 시 C로 읽힌다.따라서 중황산염 염기서열처리는 5-메틸시토신과 5-히드록시메틸시토신을 구별할 수 없다.이는 5-메틸시토신과 5-히드록시메틸시토신의 합성물이므로 더 이상 비황산염 염기서열 처리의 출력을 DNA 메틸화만으로 정의할 수 없음을 의미한다.Chuan He의 Chuan He에 의한 Tet-assisted 산화성 황산수소염 염기서열 분석의 개발은 [25]이제 단일 염기 분해능에서 두 가지 변형을 구별할 수 있다.

불완전한 변환

중황산염 배열은 모든 비메틸화 시토신 잔기의 유라실로의 전환에 의존한다.변환이 완료되지 않은 경우 후속 분석은 변환되지 않은 비메틸화 세포신을 메틸화 세포신으로 잘못 해석하여 메틸화에 대한 잘못된 양성 결과를 초래합니다.단가닥 DNA의 사이토신만이 아황산염의 공격을 받기 쉽기 때문에 분석 중인 DNA의 변성이 [2]매우 중요하다.온도 및 염분 농도와 같은 반응 매개변수가 DNA를 단일 가닥 형태로 유지하고 완전한 변환을 가능하게 하는 데 적합한지 확인하는 것이 중요합니다.DNA를 아가로스 겔에 내장하는 것은 DNA 가닥을 물리적으로 [26]분리하여 전환 속도를 향상시키는 것으로 보고되었다.

아황산염 처리 중 DNA 분해

아황산염 염기서열 분석의 주요 과제는 변환과 동시에 일어나는 DNA의 분해이다.긴 배양시간, 높은 온도, 높은 중황산염 농도 등 완전한 변환에 필요한 조건은 배양된 [27]DNA의 약 90%를 열화시킬 수 있으며, DNA의 시작량이 한정되어 있는 경우가 많기 때문에 이러한 광범위한 열화는 문제가 될 수 있다.열화는 탈수로 인해 [28]발생하며, 그 결과 랜덤 가닥이 끊어집니다.따라서 원하는 PCR 엠프리콘이 길수록 온전한 템플릿 분자의 수가 제한될 수 있습니다.이는 PCR 증폭의 실패 또는 템플릿 분자의 제한된 샘플링으로 인해 발생하는 메틸화 수준에 대한 정량적으로 정확한 정보의 손실을 초래할 수 있다.따라서 사용된 반응 조건에서 발생하는 DNA 열화의 양을 평가하고 이것이 원하는 앰피콘에 어떤 영향을 미칠지 고려하는 것이 중요합니다.배양 [28]온도 사이클링과 같은 DNA 열화를 최소화하기 위해 기술을 사용할 수도 있습니다.

2020년 뉴잉글랜드 바이오랩스는 DNA [29]손상을 최소화하기 위한 대체 효소적 접근법인 NEBNext Enzymatic Methyl-seq를 개발했다.

기타 우려 사항

중황산염 처리 후 잠재적으로 중요한 문제는 용액의 알칼리화가 불충분하여 피리미딘 잔류물의 불완전한 탈황이다.이로 인해 일부 DNA 중합효소가 억제되어 후속 PCR이 어려워질 수 있습니다.단, 탈황의 [2]완료를 확인하기 위해 용액의 pH를 감시함으로써 이러한 상황을 피할 수 있다.

마지막 우려 사항은 중황산염 처리가 샘플의 복잡도 수준을 크게 감소시킨다는 것이며, 이는 여러 PCR 반응을 수행할 경우 문제가 될 수 있다(2006년).[5]프라이머 설계는 더 어렵고 부적절한 교잡은 더 자주 발생합니다.

응용 프로그램: 게놈 전체 메틸화 분석

아황산염 염기서열 분석의 진보는 DNA 메틸화의 전지구적 측정이 제한적 게놈 스캔과 같은 다른 기술을 통해서만 가능했던 게놈 전체에 적용할 수 있는 가능성을 가져왔다.인간 후생유전자의 지도는 많은 과학자들에 의해 인간 게놈 프로젝트의 [30][31]완성에 대한 논리적 후속 조치로 여겨진다.이 후생유전학적 정보는 유전자 배열의 기능이 어떻게 구현되고 조절되는지를 이해하는 데 중요할 것이다.후생유전자는 게놈보다 안정성이 떨어지기 때문에 유전자-환경 [32]상호작용에서 중요하다고 생각된다.

후생유전학적 매핑은 후생유전자가 게놈보다 훨씬 다양하기 때문에 유전체 배열보다 본질적으로 더 복잡하다.후생유전자는 연령에 따라 다르며 조직마다 다르며 환경적 요인에 의해 변화하며 질병에서 이상을 보인다.그러나 다양한 연령, 조직 유형 및 질병 상태를 나타내는 그러한 풍부한 후생유전학적 매핑은 노화와 질병을 초래하는 메커니즘뿐만 아니라 후생유전적 표시의 정상적인 기능에 대한 귀중한 정보를 제공할 것이다.

후생유전학적 매핑의 직접적인 이점에는 클로닝 기술의 발전 가능성이 있습니다.정상적인 생존력과 수명을 가진 복제동물을 생산하지 못하는 것은 부적절한 후생유전학적 표시 패턴에서 비롯된다고 믿어진다.또한 이상 메틸화 패턴은 많은 암에서 잘 특징지어진다.전지구적 저메틸화는 게놈 안정성의 저하를 초래하는 반면, 종양 억제 유전자 촉진제의 국소적 과메틸화는 종종 기능 상실을 설명한다.메틸화의 특정 패턴은 특정 암 유형을 나타내며, 예측 값을 가지며, 최선의 [31]치료 과정을 안내하는 데 도움이 됩니다.

전 세계에서 대규모 후생유전자 매핑 작업이 진행 중이며 인간 후생유전자 프로젝트에 [32]따라 조직되었습니다.이는 다층 전략에 기초하고 있으며, 비황산염 염기서열처리는 제한된 수의 기준 후생유전자에 대한 고해상도 메틸화 프로파일을 얻기 위해 사용되는 반면, 광범위한 샘플 스펙트럼에서 덜 철저한 분석이 수행된다.고해상도 게놈 전체 매핑은 여전히 비용이 많이 들기 때문에 이 접근방식은 주어진 양의 리소스에서 얻은 통찰력을 극대화하기 위한 것입니다.

유전자 세트 분석(예를 들어 DAVID 및 GoSeq와 같은 도구를 사용)은 높은 처리량 메틸화 데이터(예: 게놈 전체 중황산염 배열)에 적용되었을 때 심각하게 편향된 것으로 나타났다. 이는 샘플 라벨 순열을 사용하거나 Cp의 수치 차이를 제어하기 위해 통계 모델을 사용하여 보정될 수 있다고 제안되었다.각 [33]유전자를 대상으로 하는 G 프로브/CpG 부위.

산화성 아황산수소염 배열법

5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신 모두 비황산염 배열에서 C로 [24]읽힌다.산화성 중황산염 배열은 단일 염기 분해능으로 5-메틸시토신과 5-히드록시메틸시토신을 구별하는 방법이다.이 방법은 5-히드록시메틸시토신에서 5-포르밀시토신으로의 특정(테트 보조) 화학적 산화를 사용하며, 이후 중황산염 [34]처리 중에 유라실로 변환됩니다.C로 판독되는 유일한 염기는 5-메틸시토신이며, DNA 샘플의 실제 메틸화 상태에 대한 지도를 제공합니다.또한 5-히드록시메틸시토신의 농도는 비황산염과 산화성 비황산염의 배열 차이를 측정하여 정량화할 수 있다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Chatterjee A, Stockwell PA, Rodger EJ 및 Morison IM 2012.게놈 전체 비술파이트 배열 데이터를 위한 정렬 소프트웨어 비교.핵산 연구 40(10): e79.
  2. ^ a b c Fraga MF, Esteller M (September 2002). "DNA methylation: a profile of methods and applications". BioTechniques. 33 (3): 632, 634, 636–49. doi:10.2144/02333rv01. PMID 12238773.
  3. ^ El-Maarri O (2003). "Methods: DNA methylation". Peroxisomal Disorders and Regulation of Genes. Advances in Experimental Medicine and Biology. Vol. 544. pp. 197–204. doi:10.1007/978-1-4419-9072-3_23. ISBN 978-0-306-48174-1. PMID 14713229.
  4. ^ Laird PW (April 2003). "The power and the promise of DNA methylation markers". Nature Reviews. Cancer. 3 (4): 253–66. doi:10.1038/nrc1045. PMID 12671664. S2CID 19574628.
  5. ^ a b Callinan PA, Feinberg AP (April 2006). "The emerging science of epigenomics". Human Molecular Genetics. 15 Spec No 1 (90001): R95-101. doi:10.1093/hmg/ddl095. PMID 16651376.
  6. ^ a b Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, et al. (March 1992). "A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5): 1827–31. Bibcode:1992PNAS...89.1827F. doi:10.1073/pnas.89.5.1827. PMC 48546. PMID 1542678.
  7. ^ Colella S, Shen L, Baggerly KA, Issa JP, Krahe R (July 2003). "Sensitive and quantitative universal Pyrosequencing methylation analysis of CpG sites". BioTechniques. 35 (1): 146–50. doi:10.2144/03351md01. PMID 12866414.
  8. ^ Tost J, Dunker J, Gut IG (July 2003). "Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpG islands by Pyrosequencing". BioTechniques. 35 (1): 152–6. doi:10.2144/03351md02. PMID 12866415.
  9. ^ Wong HL, Byun HM, Kwan JM, Campan M, Ingles SA, Laird PW, Yang AS (December 2006). "Rapid and quantitative method of allele-specific DNA methylation analysis". BioTechniques. 41 (6): 734–9. doi:10.2144/000112305. PMID 17191619.
  10. ^ Bianco T, Hussey D, Dobrovic A (1999). "Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation". Human Mutation. 14 (4): 289–93. doi:10.1002/(SICI)1098-1004(199910)14:4<289::AID-HUMU3>3.0.CO;2-A. PMID 10502775. S2CID 22814772.
  11. ^ Wojdacz TK, Dobrovic A (2007). "Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation". Nucleic Acids Research. 35 (6): e41. doi:10.1093/nar/gkm013. PMC 1874596. PMID 17289753.
  12. ^ Gonzalgo ML, Jones PA (June 1997). "Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)". Nucleic Acids Research. 25 (12): 2529–31. doi:10.1093/nar/25.12.2529. PMC 146734. PMID 9171109.
  13. ^ Uhlmann K, Brinckmann A, Toliat MR, Ritter H, Nürnberg P (December 2002). "Evaluation of a potential epigenetic biomarker by quantitative methyl-single nucleotide polymorphism analysis". Electrophoresis. 23 (24): 4072–9. doi:10.1002/elps.200290023. PMID 12481262. S2CID 43737807.
  14. ^ Matin MM, Baumer A, Hornby DP (October 2002). "An analytical method for the detection of methylation differences at specific chromosomal loci using primer extension and ion pair reverse phase HPLC". Human Mutation. 20 (4): 305–11. doi:10.1002/humu.10118. PMID 12325026. S2CID 3178841.
  15. ^ Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, Zabeau M, Liloglou T, Xinarianos G, et al. (November 2005). "Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base-specific cleavage and mass spectrometry". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44): 15785–90. Bibcode:2005PNAS..10215785E. doi:10.1073/pnas.0507816102. PMC 1276092. PMID 16243968.
  16. ^ Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (September 1996). "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18): 9821–6. Bibcode:1996PNAS...93.9821H. doi:10.1073/pnas.93.18.9821. PMC 38513. PMID 8790415.
  17. ^ Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D, et al. (April 2000). "MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation". Nucleic Acids Research. 28 (8): 32e–0. doi:10.1093/nar/28.8.e32. PMC 102836. PMID 10734209.
  18. ^ Rand K, Qu W, Ho T, Clark SJ, Molloy P (June 2002). "Conversion-specific detection of DNA methylation using real-time polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives". Methods. 27 (2): 114–20. doi:10.1016/S1046-2023(02)00062-2. PMID 12095268.
  19. ^ Akey DT, Akey JM, Zhang K, Jin L (October 2002). "Assaying DNA methylation based on high-throughput melting curve approaches". Genomics. 80 (4): 376–84. doi:10.1006/geno.2002.6851. PMID 12376091.
  20. ^ Kristensen LS, Mikeska T, Krypuy M, Dobrovic A (April 2008). "Sensitive Melting Analysis after Real Time- Methylation Specific PCR (SMART-MSP): high-throughput and probe-free quantitative DNA methylation detection". Nucleic Acids Research. 36 (7): e42. doi:10.1093/nar/gkn113. PMC 2367707. PMID 18344521.
  21. ^ Adorján P, Distler J, Lipscher E, Model F, Müller J, Pelet C, et al. (March 2002). "Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis". Nucleic Acids Research. 30 (5): 21e–21. doi:10.1093/nar/30.5.e21. PMC 101257. PMID 11861926.
  22. ^ Tahiliani M, Ko KP, Shen Y, WA 목사, Bandukwala H, BrudnoY 등MLL 파트너 TET1에 의한 5-메틸시토신의 5-히드록시메틸시토신 인마말리안 DNA로의 변환.과학.2009;324(5929):930-5.
  23. ^ 크라우치오니스 S, 하인츠 N.핵 DNA 염기 5-히드록시메틸시토신은 푸르키네 뉴런과 뇌에 존재한다.과학.2009;324(5929):929-30.
  24. ^ a b Huang Y, Wa 목사, Shen Y, Tahiliani M, Liu DR, Rao A.5-히드록시메틸시토신의 비술파이트 배열 거동.PLOS ONE.2010;5 (1):e8888.
  25. ^ Yu, M., Hon, G. C., Sulwach, K. E., Song, C., Jin, P., Ren, B., He, C. 테트 보조 중황산염 배열 5-히드록시메틸시토신.NAT 프로토콜 2012, 7, 2159
  26. ^ Olek A, Oswald J, Walter J (December 1996). "A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis". Nucleic Acids Research. 24 (24): 5064–6. doi:10.1093/nar/24.24.5064. PMC 146326. PMID 9016686.
  27. ^ Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A (July 2001). "Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters". Nucleic Acids Research. 29 (13): E65-5. doi:10.1093/nar/29.13.e65. PMC 55789. PMID 11433041.
  28. ^ a b Ehrich M, Zoll S, Sur S, van den Boom D (2007). "A new method for accurate assessment of DNA quality after bisulfite treatment". Nucleic Acids Research. 35 (5): e29. doi:10.1093/nar/gkl1134. PMC 1865059. PMID 17259213.
  29. ^ Gautreau, Isabel (2014-09-29). "NEBNext End Prep Mixture v1". protocols.io. doi:10.17504/protocols.io.cg4tyv. Retrieved 2021-05-19.
  30. ^ Esteller M (June 2006). "The necessity of a human epigenome project". Carcinogenesis. 27 (6): 1121–5. doi:10.1093/carcin/bgl033. PMID 16699174.
  31. ^ a b Bradbury J (December 2003). "Human epigenome project--up and running". PLOS Biology. 1 (3): E82. doi:10.1371/journal.pbio.0000082. PMC 300691. PMID 14691553.
  32. ^ a b Jones PA, Martienssen R (December 2005). "A blueprint for a Human Epigenome Project: the AACR Human Epigenome Workshop". Cancer Research. 65 (24): 11241–6. doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3865. PMID 16357125.
  33. ^ Geeleher P, Hartnett L, Egan LJ, Golden A, Raja Ali RA, Seoighe C (August 2013). "Gene-set analysis is severely biased when applied to genome-wide methylation data". Bioinformatics. 29 (15): 1851–7. doi:10.1093/bioinformatics/btt311. PMID 23732277.
  34. ^ Booth MJ, Branco MR, Ficz G, Oxley D, Krueger F, Reik W 등단일 염기 분해능에서 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신의 정량적 염기서열 분석.과학. 2012;336(6083):934-7.

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