지향적 진화

Directed evolution
유도 진화(트랜스 휴머니즘)와 혼동하지 말 것.
자연 진화와 비교한 유도 진화의 예.내부 주기는 괄호 안에 있는 자연 과정을 모방한 방향성 진화 주기의 3단계를 나타냅니다.외부 원은 일반적인 실험의 단계를 보여줍니다.빨간색 기호는 기능적 변형을 나타내며, 옅은 기호는 기능이 저하된 변형을 나타냅니다.

방향 진화(DE)는 단백질 또는 핵산을 사용자 정의 목표를 [1]향해 유도하기 위해 자연 선택 과정을 모방하는 단백질 공학에서 사용되는 방법입니다.유전자에 돌연변이 유발(변형 라이브러리 생성), 선택(변형을 표현하고 원하는 기능을 가진 구성원을 분리) 및 증폭(다음 단계를 위한 템플릿 생성)을 반복하는 것으로 구성됩니다.생체 내(생체 내) 또는 생체 내(세포 내 또는 용액 내 자유)로 수행될 수 있다.방향 진화는 이성적으로 변형된 단백질을 설계하는 대안으로 단백질 공학뿐만 아니라 통제된 실험실 환경에서 기본적인 진화 원리에 대한 실험적인 진화 연구에도 사용된다.

역사

지향적 진화는 1960년대에[2] "슈피겔만의 괴물"[3] 실험에서 RNA 분자의 진화와 함께 그 기원을 가지고 있다.이 개념은 [4]게놈에서 단일 유전자의 진화를 선호하는 선택 압력 하에서 박테리아의 진화를 통한 단백질 진화로 확장되었다.

1980년대 초기 파지 표시 기술은 단일 [5]단백질에 대한 돌연변이와 선택을 가능하게 했다.이것은 강화된 결합 단백질의 선택을 가능하게 했지만,[6] 효소의 촉매 활성에 대한 선택과는 아직 양립할 수 없었다.효소를 진화시키는 방법들은 1990년대에 개발되었고 그 기술을 더 많은 과학자들에게 [7]가져왔다.그 분야는 유전자 변이체의 라이브러리를 만들고 그들의 [2][8]활동을 선별하는 새로운 방법으로 빠르게 확장되었다.2018년에는 효소의 진화에 대한 공로로 프랜시스 아놀드, 파이지 [9]디스플레이에 대한 공로로 조지 스미스와 그레고리 윈터에게 노벨 화학상을 수여하는 등 방향성 진화법의 개발이 영예를 안았다.

원칙

지향적 진화는 고도가 원하는 특성을 나타내는 '적합성 풍경'의 언덕을 오르는 것과 유사합니다.각 선택 라운드는 시작 템플릿(1)의 모든 면에서 돌연변이를 샘플링하여 가장 높은 고도를 가진 돌연변이를 선택하고 언덕을 오른다.이것은 로컬 서밋에 도달할 때까지 반복된다(2).

유도 진화는 실험실 환경에서 자연 진화 주기를 모방한 것입니다.진화에는 세 가지가 필요합니다. 즉, 복제자 간의 변동, 변동으로 인해 선택이 작용하는 적합성 차이가 발생하며 이 변동은 상속할 수 있습니다.DE에서 단일 유전자는 돌연변이 유발, 선택 또는 스크리닝, [10]증폭의 반복 라운드에 의해 진화한다.이러한 순서의 라운드는 일반적으로 반복되며, 한 라운드의 최적의 변형을 다음 라운드의 템플릿으로 사용하여 단계적 개선을 달성합니다.

더 많은 돌연변이를 평가하면 원하는 [11]성질을 가진 돌연변이를 찾을 가능성이 높아지기 때문에 유도 진화 실험의 성공 가능성은 총 라이브러리 크기와 직접적으로 관련이 있습니다.

변동 생성

시작 유전자(왼쪽) 및 변형 라이브러리(오른쪽)점 돌연변이는 단일 뉴클레오티드를 변화시킨다.삽입 및 삭제는 DNA의 단면을 추가하거나 제거합니다.셔플링은 두 개 이상의 유사한 유전자의 세그먼트를 재결합합니다.
무작위 돌연변이 유발 샘플 시퀀스 공간에 의해 생성된 DNA 라이브러리.주어진 위치에 치환된 아미노산이 표시된다.연결된 각 점 또는 점 세트는 라이브러리의 한 구성원입니다.오류가 발생하기 쉬운 PCR은 일부 잔류물을 다른 아미노산으로 무작위로 변이시킨다.알라닌 스캔은 단백질의 각 잔류물을 알라닌으로 하나씩 대체한다.부위 포화도는 20개의 가능한 아미노산(또는 일부 아미노산)을 하나씩 단일 위치에서 치환합니다.

유도 진화의 순환을 수행하는 첫 번째 단계는 변형 유전자의 라이브러리 생성이다.무작위130 배열의 배열 공간은 광활하고(100개의 아미노산 단백질에 대해 10개의 가능한 배열) 기능성 단백질에 의해 매우 희박하게 채워진다.실험적인 [12]것도[13][failed verification] 자연진화도 이렇게 많은 시퀀스를 샘플링할 수 없습니다.물론 자연진화는 기능성 단백질 배열에 가까운 변종 배열을 샘플링하고, 이는 이미 기능성 유전자를 돌연변이 유발함으로써 DE에서 모방된다.일부 계산에 따르면 모든 실용적(즉, 기능적 및 구조적) 목적을 위해,[13] 단백질 배열 공간이 지구상의 생명체 진화 과정에서 완전히 탐색되는 것이 전적으로 타당하다.

시작 유전자는 무작위 점 돌연변이(화학 돌연변이 또는 오류 발생 PCR에 의해)[14][15]와 삽입 및 결손(트랜스포존에 [16]의해)에 의해 돌연변이 유발될 수 있다.유전자 재조합은 여러 배열(보통 70% 이상의 배열 동일성)의 DNA 교반으로[17][18] 인해 교반된 부모 유전자 사이의 배열 공간 영역으로 점프함으로써 모방될 수 있다.마지막으로 유전자의 특정 영역은 구조 및 기능지식에 기초한 보다 집중적인 접근을 위해 체계적으로 무작위화할[19] 수 있다.메서드에 따라 생성되는 라이브러리는 포함된 기능적 변형의 비율에 따라 달라집니다.비록 유기체가 관심 있는 유전자를 발현하기 위해 사용되더라도, 그 유전자만을 돌연변이시킴으로써 유기체의 나머지 게놈은 그대로 유지되고 진화 실험에서는 무시할 수 있다.

적합성 차이 감지

대부분의 돌연변이는 유해하기 때문에 돌연변이의 라이브러리는 대부분 [20]활동이 감소된 변형을 갖는 경향이 있다.따라서 원하는 특성을 개선하는 유익한 돌연변이를 가진 희귀 변이를 찾기 위한 활성 측정에는 높은 처리량 검사가 필수적입니다.기능적 변형을 분리하기 위한 방법의 두 가지 주요 범주가 존재한다.선택 시스템은 단백질 기능을 유전자의 생존에 직접 결합하는 반면 스크리닝 시스템은 각 변종을 개별적으로 검사하고 원하는 활성 변종의 변종 또는 모집단을 분류하기 위해 정량적 임계값을 설정할 수 있다.선택과 스크리닝은 살아있는 세포에서 수행되거나(체외 진화) 세포 없이 단백질 또는 RNA에서 직접 수행될 수 있다(체외 진화).[21][22]

체내 진화 중에 각 세포(일반적으로 박테리아 또는 효모)는 변형 라이브러리의 다른 구성원을 포함하는 플라스미드로 변환된다.이런 식으로, 다른 모든 유전자들은 동일하게 유지되고, 오직 관심 있는 유전자만이 세포들 사이에 다르다.세포는 세포질이나 그 기능을 시험할 수 있는 표면에서 단백질을 발현시킨다.이 형식은 세포 환경에서 특성을 선택할 수 있는 장점이 있으며, 이것은 살아있는 유기체에서 진화된 단백질 또는 RNA를 사용할 때 유용합니다.세포 없이 수행될 때, DE는 시험관내 전사 변환을 사용하여 용액 또는 인공 마이크로드롭으로 구분된 단백질 또는 RNA를 생산한다.이 방법은 선택 조건(예: 온도, 용매)에서 더 다재다능하다는 장점이 있으며 세포에 독성이 있는 단백질을 발현할 수 있다.더욱이, 시험관내 진화 실험은 라이브러리 DNA를 세포에 삽입할 필요가 없기 때문에 훨씬 더 큰 라이브러리(최대15 10개)를 생성할 수 있다.

선택.

바인딩 액티비티의 선택은 개념적으로 간단합니다.표적 분자는 단단한 지지대 위에 고정되고, 변형 단백질의 라이브러리가 흐르며, 빈약한 결합체가 씻겨나가고,[23] 나머지 결합 변형체들은 그들의 유전자를 분리하기 위해 회복된다.고정화된 공유가 억제제에 대한 효소의 결합은 활성 촉매를 분리하기 위한 시도로도 사용되어 왔다.그러나 이 접근 방식은 단일 촉매 교체를 위한 것일 뿐이며 기판 결합 또는 실제 기판 반응성의 좋은 모델이 아닙니다.만약 중요한 대사물을 합성하거나 독소를 파괴함으로써, 효소활동이 세포생존에 필요할 수 있다면, 세포생존은 효소활성의 [24][25]함수이다.이러한 시스템은 일반적으로 셀의 변환 효율에 의해서만 throughput이 제한됩니다.또한 스크리닝보다 비용이 적게 들고 노동집약적이기는 하지만 일반적으로 엔지니어링이 어렵고 예술품이 되기 쉬우며 라이브러리에 존재하는 활동 범위에 대한 정보를 제공하지 않습니다.

스크리닝

선발의 대안은 선별 시스템이다.각 변종 유전자는 개별적으로 발현되고 측정되어 활성을 정량적으로 측정한다(대부분은 색소 생성물 또는 불소 생성물에 의해).그런 다음 변종들의 순위를 매기고 실험자는 다음 DE 라운드의 템플릿으로 사용할 변종을 결정한다. 가장 높은 처리량 평가조차도 일반적으로 선택 방법보다 적용 범위가 낮지만 선별된 각 변종들에 대한 세부 정보를 생성할 수 있는 이점을 제공한다.이 세분화된 데이터는 또한 단순한 선택 시스템에서는 가능하지 않은 라이브러리의 활동 분포를 특징짓는 데 사용될 수 있다.따라서 스크리닝 시스템은 적응 진화와 적합성 환경을 실험적으로 특징짓는 데 있어 이점이 있다.

유전성 확보

발현 단백질은 그 유전자와 공유 결합(mRNA, 왼쪽)되거나 그것(세포 또는 인공 구획, 오른쪽)으로 구분될 수 있다.어느 쪽이든 유전자가 암호화된 단백질의 활성에 기반하여 분리될 수 있다는 것을 보증한다.

기능성 단백질이 분리되면 유전자도 분리되어야 하므로 유전자형-표현형 연결이 필요하다.[24]이것은 mRNA 유전자가 푸로마이신에 [12]의해 번역이 끝날 때 단백질과 연결되어 있는 mRNA 표시와 같이 공유될 수 있습니다.또는 단백질과 그 유전자는 살아있는[26] 세포 또는 유화액 [27]방울의 구획화에 의해 함께 국재할 수 있다.분리된 유전자 배열은 PCR 또는 변형된 숙주 박테리아에 의해 증폭된다.단일 최적의 시퀀스 또는 시퀀스 풀을 다음 돌연변이 발생의 템플릿으로 사용할 수 있습니다.다양화-선택-증폭의 반복된 주기는 적용된 선택 압력에 적합한 단백질 변형을 생성한다.

합리적인 단백질 설계와의 비교

직접 진화의 이점

단백질의 합리적 설계는 단백질 구조와 그 촉매 메커니즘에 [28][29]대한 심층적인 지식에 의존한다.다음으로 단백질의 기능을 변화시키기 위해 부위 지향 돌연변이 유발에 의해 특정 변화가 이루어진다.단점은 단백질의 구조와 작용 메커니즘이 잘 알려져 있어도 돌연변이에 의한 변화를 예측하기 어렵다는 것이다.따라서 DE의 장점은 원하는 활성의 메커니즘이나 돌연변이가 원하는 [30]활성에 미치는 영향을 이해할 필요가 없다는 것이다.

직접 진화의 한계

방향 진화의 제한은 다수의 다른 무작위 돌연변이의 영향을 측정하기 위해 높은 처리량 분석이 필요하다는 것입니다.이것은 직접적인 진화에 사용하기 전에 광범위한 연구와 개발이 필요할 수 있다.또한 이러한 평가는 특정 활동을 모니터링하는 데 매우 고유하기 때문에 새로운 DE [31]실험으로 전송할 수 없습니다.

또한, 피측정 기능의 개선을 위해 선택하면 피측정 기능의 개선이 발생할 뿐입니다.이러한 개선이 어떻게 이루어졌는지 이해하기 위해서는 진화하는 효소의 특성을 측정해야 합니다.측정 활성의 개선은 효소 촉매 활성 또는 효소 농도의 개선 때문일 수 있습니다.한 기판의 개선이 다른 기판의 활성을 개선한다는 보장도 없다.이는 원하는 활성을 직접 선별하거나 선택할 수 없기 때문에 '대리' 기질을 사용할 때 특히 중요합니다.DE는 원하는 활동을 개선하지 않고 프록시에 대한 진화적 전문화를 이끌 수 있다.따라서 [32]DE를 성공시키기 위해서는 적절한 스크리닝 또는 선택 조건을 선택하는 것이 중요하다.

실험에서 진화의 속도는 또한 유도 진화의 효용에 제한을 가한다.예를 들어, 특정 표현형의 진화는 이론적으로는 가능하지만 실질적으로 [33]가능하지 않은 시간 척도에서 발생할 수 있다.최근의 이론적 접근법은 통계물리학의 역방향 주행 기법을 적용하여 속도의 한계를 극복하는 것을 목표로 하고 있으나, 이는 아직 직접적인 진화 [34]실험에서 구현되지 않았다.

조합적 접근법

조합된 '반합리적' 접근법은 합리적 설계와 지향적 [1][35]진화의 한계를 해결하기 위해 조사되고 있다.유익한 돌연변이는 드물기 때문에, 개선된 변이를 찾기 위해 많은 수의 무작위 돌연변이를 선별해야 한다.'집중 라이브러리'는 DE의 돌연변이 발생 단계에서 유익한 돌연변이가 더 풍부하다고 생각되는 영역을 랜덤화하는 데 초점을 맞추고 있다.집중 라이브러리는 기존의 무작위 돌연변이 발생 라이브러리보다 변형이 적기 때문에 이러한 높은 처리량 스크리닝이 필요하지 않다.

포커스 라이브러리를 작성하려면 변환하는 구조 내의 잔류물에 대한 지식이 필요합니다.예를 들어 효소의 활성 부위에 대한 지식은 기질과 상호작용하는 것으로 알려진 잔류물만 무작위화할 [36][37]수 있다.또는 어떤 단백질 영역이 본질적으로 가변적인지에 대한 지식은 이러한 [38][39]영역에서만 돌연변이 유발을 유도할 수 있다.

적용들

방향 진화는 합리적인 [40]설계의 대안으로 단백질 공학을 위해 자주 사용되지만, 효소 [41]진화의 근본적인 문제를 조사하는데도 사용될 수 있다.

단백질 공학

단백질 엔지니어링 툴로서 DE는 3가지 분야에서 가장 성공적이었습니다.

  1. 고온 또는 가혹한[42][43][44] 용매에서 생명공학적으로 사용하기 위한 단백질 안정성 향상
  2. 치료용 항체의 결합 친화력(Affinity 성숙)[45] 및 de novo 설계[30] 효소의 활성 개선
  3. 기존 [46][47][48][49]효소의 기질 특이성 변경(종 [40]업계에서 사용)

진화 연구

다음 항목도 참조하십시오.실험 진화

자연 진화에 대한 연구는 전통적으로 현존하는 유기체와 그 유전자에 기초하고 있다.하지만, 연구는 화석의 부족과 고대 [50][51]환경 조건에 대한 불완전한 지식에 의해 근본적으로 제한됩니다.유도 진화는 개별 효소,[52][53][35] 리보자임[54] 및 복제자에[55][3] 대한 제어된 유전자 시스템에서 진화를 조사합니다(진핵생물,[56][57] 원핵생물[58] 및 바이러스의[59] 실험 진화와 유사).

DE는 선택 압력, 돌연변이율 및 환경(온도 등의 비생물 환경 및 생물 내 다른 유전자와 같은 생물 환경)을 제어할 수 있습니다.또한, 모든 진화 중간 유전자에 대한 완전한 기록이 있다.이를 통해 인식, 진화 가능성, 적응적 제약 조건[60][61] 적합성 [62]환경 및 중립 [63]네트워크와 같은 진화 과정의 상세한 측정을 할 수 있습니다.

미생물 프로테옴의 적응적 실험실 진화

프로테옴의 자연 아미노산 조성은 실험적으로 가해진 선택 압력 하에서 적절한 비표준 아미노산 치환으로 글로벌 표준 아미노산 치환에 의해 변경될 수 있다.예를 들어 대장균과 서브틸리스균에서[64] 천연 아미노산을 불소화 아날로그로 전지구적으로 치환하는 것이 시도되고 있다.[65]2015년 Budisa와 Söll에 [66]의해 대장균에서 20899 UGG 코돈에 대한 티에노피롤-알라닌의 완전한 트립토판 치환이 보고되었다.미생물 균주의 실험적인 진화와 아미노산의 명확한 수용은 실험적으로 [67]유전자 코드를 넓히는 데 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.방향 진화는 일반적으로 돌연변이 발생을 위한 특정 유전자를 대상으로 하고 그 결과 나타나는 변형을 선별하는 반면, 적응형 실험실 진화는 활발하게 성장하는 [68]문화의 적합성에 기여하는 많은 게놈 전체의 돌연변이를 선택한다.

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