단백질공학

단백질 공학은 유용하거나 가치 있는 단백질을 개발하는 과정이다. 단백질 접힘에 대한 이해와 단백질 설계 원리에 대한 인식에 대한 많은 연구가 이루어지고 있는 젊은 학문이다. 상품 및 서비스 시장이기도 하며, 2017년까지 추정가치가 1,680억 달러에 달한다.^[1]

단백질 공학을 위한 두 가지 일반적인 전략이 있다: 이성적인 단백질 설계와 지시된 진화. 이 방법들은 상호 배타적이지 않다; 연구자들은 종종 이 두 가지 방법을 모두 적용할 것이다. 앞으로 단백질 구조와 기능에 대한 보다 상세한 지식과 고투과 스크리닝의 진보가 단백질 공학의 능력을 크게 확대할 수 있을 것이다. 결국, 유전 코드에 새로운 아미노산을 인코딩할 수 있는 확장된 유전 코드와 같은 새로운 방법을 통해 부자연스러운 아미노산도 포함될 수 있다.

접근

합리적 디자인

합리적인 단백질 설계에서, 과학자는 원하는 변화를 만들기 위해 단백질의 구조와 기능에 대한 상세한 지식을 사용한다. 일반적으로 이것은 사이트 지향 돌연변이 유발 방법이 잘 발달되어 있기 때문에 저렴하고 기술적으로 쉽다는 장점이 있다. 그러나, 그것의 주요한 단점은 단백질의 상세한 구조적 지식이 종종 불가능하고, 이용할 수 있는 경우에도 구조 정보가 단백질 구조의 정적 그림을 가장 많이 제공하기 때문에 다양한 돌연변이의 영향을 예측하는 것은 매우 어려울 수 있다는 것이다. 그러나, 폴딩@home과 폴디트 같은 프로그램들은 단백질의 접히는 모티브에 대한 통찰력을 얻기 위해 크라우드소싱 기술을 활용했다.^[2]

계산 단백질 설계 알고리즘은 사전 지정된 표적 구조로 접었을 때 에너지가 낮은 새로운 아미노산 시퀀스를 식별하는 방법을 모색한다. 검색이 필요한 시퀀스 적합 공간은 크지만, 계산 단백질 설계 시 가장 까다로운 요건은 최적의 시퀀스와 유사한 차선의 시퀀스를 구별할 수 있는 빠르고 정확한 에너지 기능이다.

다중 시퀀스 정렬

단백질에 대한 구조적 정보가 없다면, 시퀀스 분석은 종종 단백질에 대한 정보를 설명하는데 유용하다. 이러한 기법은 표적 단백질 시퀀스를 다른 관련 단백질 시퀀스와 정렬하는 것을 포함한다. 이 정렬은 어떤 아미노산이 종들 사이에 보존되어 있고 단백질의 기능에 중요한지를 보여줄 수 있다. 이러한 분석은 돌연변이의 대상 부위가 될 수 있는 핫 스폿 아미노산을 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 다중 시퀀스 정렬은 알려진 시퀀스와 대상 단백질 시퀀스를 상호 참조하기 위해 PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE, BALIBASE 등의 데이터 베이스를 활용한다. 다중 시퀀스 정렬 기법은 아래에 열거되어 있다.^{[3][page needed]}

이 방법은 k-tuple 또는 Needleman–을 사용하여 시퀀스의 쌍방향 정렬을 수행하는 것으로 시작한다.Wunsch 방식. 이 방법들은 시퀀스 쌍들 간의 쌍의 현명한 유사성을 나타내는 행렬을 계산한다. 그런 다음 유사성 점수는 인접 결합 방법을 사용하여 안내 트리를 생성하는 데 사용되는 거리 점수로 변환된다. 이 안내 트리는 다중 시퀀스 정렬을 위해 사용된다.^{[3][page needed]}

크러스트 오메가

k-tuple 방식을 활용해 최대 19만 개의 시퀀스를 정렬할 수 있는 방식이다. 다음 시퀀스는 mBed 및 k-means 방법을 사용하여 군집화된다. 그런 다음 HH 정렬 패키지에 사용되는 UPGMA 방법을 사용하여 가이드 트리를 생성한다. 이 안내 트리는 다중 시퀀스 정렬을 생성하는 데 사용된다.^{[3][page needed]}

MAFFT

이 방법은 아미노산 시퀀스를 각 아미노산 잔류물의 부피와 극성 값으로 구성된 시퀀스로 변환하는 빠른 푸리에 변환(FFT)을 활용한다. 이 새로운 순서는 동음이의 영역을 찾는 데 사용된다.^{[3][page needed]}

케이앨린

이 방법은 Wu-Manber 근사 문자열 매칭 알고리즘을 활용하여 다중 시퀀스 정렬을 생성한다.^{[3][page needed]}

로그 예상값(USCLE)에 의한 다중 시퀀스 비교

이 방법은 Kmer와 Kimura 거리를 활용하여 다중 시퀀스 정렬을 생성한다.^{[3][page needed]}

티커피

이 방법은 정렬 진화를 위해 트리 기반의 일관성 목표 기능을 활용한다. 이 방법은 Clustal W보다 5~10% 정도 정확도가 높은 것으로 나타났다.^{[3][page needed]}

공진화 분석

공진화 분석은 상관 돌연변이, 공분산 또는 공분산이라고도 한다. 이러한 유형의 합리적 설계는 진화적으로 상호작용하는 위치에서의 상호 진화적 변화를 포함한다. 일반적으로 이 방법은 목표 시퀀스에 대한 큐레이션된 다중 시퀀스 정렬의 생성으로 시작한다. 그런 다음 이 정렬은 고도로 도핑된 시퀀스뿐만 아니라 낮은 시퀀스 ID의 시퀀스를 제거하는 수동 정밀도를 받는다. 이 단계는 정렬의 품질을 높인다. 다음으로, 수동으로 처리된 정렬은 상이한 상관관계 돌연변이 알고리즘을 사용한 추가적인 공진화 측정에 활용된다. 이러한 알고리즘은 공진화 점수 매트릭스를 초래한다. 이 행렬은 다양한 유의성 시험을 적용하여 중요한 공진화 값을 추출하고 배경 노이즈를 제거함으로써 필터링된다. 공진화 측정은 성능 및 엄격성을 평가하기 위해 추가로 평가된다. 마지막으로, 이 공진화 분석의 결과는 실험적으로 검증된다.^{[3][page needed]}

구조 예측

기존 단백질 구조에 대한 지식에서 얻는 단백질 편익의 de novo 합성. 기존 단백질 구조에 대한 이러한 지식은 새로운 단백질 구조의 예측에 도움이 된다. 단백질 구조 예측 방법은 ab initio, fragment based methods, homology modeling, 단백질 나사산 등 네 가지 등급 중 하나에 속한다.^{[3][page needed]}

아비니시오

이러한 방법에는 템플릿에 대한 구조 정보를 사용하지 않고도 자유로운 모델링을 할 수 있다. Ab initio 방법은 자유 에너지의 전지구적 최소치에 해당하는 단백질의 고유 구조를 예측하는 것을 목적으로 한다. ab initio 방법의 일부 예로는 황색, 그로모스, 그로마스크, CHARMM, OPLS, ENCEP12 등이 있다. ab initio 방법에 대한 일반적인 단계는 관심 단백질의 기하학적 표현으로 시작한다. 다음으로 단백질을 위한 잠재적 에너지 기능 모델이 개발된다. 이 모델은 분자역학 전위 또는 단백질 구조에서 파생된 전위함수를 사용하여 만들어질 수 있다. 잠재적 모델의 개발에 따라 분자역학 시뮬레이션, 몬테카를로 시뮬레이션, 유전자 알고리즘을 포함한 에너지 검색 기술이 단백질에 적용된다.^{[3][page needed]}

조각 기반

이러한 방법은 생성된 단백질 순서와 일치시키기 위해 구조물에 관한 데이터베이스 정보를 사용한다. 이러한 동음이의 구조물은 가장 낮은 잠재적 에너지 점수 달성을 목표로 채점 및 최적화 절차를 사용하여 컴팩트한 구조물을 제공하기 위해 조립된다. 단편 정보용 웹서버는 I-TASER, ROSETTA, ROSETTA @집, FRANGFold, CABS 폴드, PROFESY, CREF, QUARK, 장의사, HM, ANGLO 등이다.^{[3]: 72}

호몰로지 모델링

이 방법들은 단백질의 동종학에 기초하고 있다. 이러한 방법은 비교 모델링이라고도 한다. 호몰로지 모델링의 첫 번째 단계는 일반적으로 쿼리 순서와 동질성이 있는 알려진 구조의 템플릿 시퀀스를 식별하는 것이다. 다음으로 조회 순서는 템플릿 순서에 맞춰 정렬된다. 정렬에 따라 구조적으로 보존된 영역을 템플릿 구조를 사용하여 모델링. 그 다음에는 템플릿과 구별되는 사이드 체인 및 루프의 모델링이 뒤따른다. 마지막으로 모델링된 구조는 정교함과 품질 평가를 거친다. Servers that are available for homology modeling data are listed here: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA, and I-TASSER.^{[3][page needed]}

단백질 나사산

단백질 나사산은 쿼리 시퀀스에 대한 신뢰할 수 있는 호몰로그를 찾을 수 없을 때 사용할 수 있다. 이 방법은 조회 순서와 템플릿 구조의 라이브러리를 얻는 것으로 시작한다. 다음으로, 쿼리 시퀀스는 알려진 템플릿 구조 위로 스레딩된다. 이들 후보 모델은 채점 기능을 이용해 채점을 한다. 이것들은 쿼리와 템플릿 순서의 잠재적 에너지 모델에 기초하여 점수가 매겨진다. 그런 다음 가장 낮은 잠재적 에너지 모델과의 일치를 선택한다. Methods and servers for retrieving threading data and performing calculations are listed here: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH, MUSTER.^{[3][page needed]}

합리적 설계에 대한 자세한 내용은 사이트 지향 돌연변이 유발 요인을 참조하십시오.

다중값 바인딩

다중값 바인딩을 사용하여 탐욕 효과를 통해 바인딩 특성과 친화력을 높일 수 있다. 단일 생체분자 또는 복합체에 복수의 결합 도메인을 가지면 개별 결합 사건을 통해 다른 상호작용이 발생할 가능성이 증가한다. 탐욕 또는 유효 친화력은 목표 결합을 위한 비용 및 시간 효과적인 도구를 제공하는 개별 친화력의 합계보다 훨씬 높을 수 있다.^[4]

다발성 단백질

다변성 단백질은 변환 후 수정이나 단백질 코딩 DNA 염기서열을 곱해 상대적으로 생성하기 쉽다. 다품종 및 다품종 단백질의 주요 장점은 알려진 단백질의 대상에 대한 유효 친화력을 높일 수 있다는 것이다. 다특이 결합을 유발하는 단백질의 조합을 이용한 비균형 대상의 경우 특이성을 높일 수 있어 단백질 치료제에 적용 가능성이 높다.

다변성 결합의 가장 흔한 예는 항체인데, 이등성 항체에 대한 광범위한 연구가 있다. 이등항체의 적용은 진단, 영상촬영, 예방 및 치료를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 포함한다.^[5][6]

방향 진화

지시 진화에서, 오류 발생 가능성이 있는 PCR이나 시퀀스 포화 돌연변이 유발에 의한 무작위 돌연변이 유발은 단백질에 적용되며, 원하는 특성을 가진 변형을 선택하기 위해 선택 시스템을 사용한다. 그런 다음 추가 돌연변이와 선택이 적용된다. 이 방법은 자연 진화를 모방하며, 일반적으로 합리적 설계보다 우수한 결과를 산출한다. DNA 섞기라고 불리는 추가 과정은 성공적인 변종의 조각들을 혼합하고 일치시켜 더 나은 결과를 만들어낸다. 그러한 과정은 성적 재생산 중에 자연적으로 일어나는 재조합을 모방한다. 유도 진화의 장점은 단백질의 사전 구조적 지식이 필요하지 않으며, 주어진 돌연변이가 어떤 영향을 미칠지 예측할 필요가 없다는 것이다. 실제로, 원하는 변화는 종종 어떤 효과를 기대하지 않았던 돌연변이에 의해 발생한다는 점에서 방향화된 진화 실험의 결과는 종종 놀랍다. 단점은 모든 단백질에 대해 가능하지 않은 고투과 스크리닝이 필요하다는 것이다. 다량의 재조합 DNA를 변이하고 원하는 특성을 검사해야 한다. 많은 수의 변종들은 종종 그 과정을 자동화하기 위해 값비싼 로봇 장비를 필요로 한다. 또한 원하는 모든 활동을 쉽게 선별할 수 있는 것은 아니다.

자연 다윈의 진화는 촉매제를 포함한 다양한 용도에 대한 단백질 특성을 맞춤화하는 방향으로 연구실에서 효과적으로 모방될 수 있다. 크고 다양한 단백질 라이브러리를 생산하고 접힌 기능 변형을 선별 또는 선택하기 위해 많은 실험 기술이 존재한다. 접힌 단백질은 무작위 시퀀스 공간에서 놀라울 정도로 빈번하게 발생하는데, 이는 선택적 바인더와 촉매의 진화에 악용될 수 있는 발생이다. 심층 시퀀스 공간에서 직접 선택하는 것보다 보수적이긴 하지만, 무작위 돌연변이 유발과 선택/비늘링에 의한 기존 단백질의 재설계는 특히 현존하는 특성을 최적화하거나 변화시키는 강력한 방법이다. 그것은 또한 더 야심찬 엔지니어링 목표를 달성하기 위한 훌륭한 출발점을 나타낸다. 실험 진화를 현대적인 계산법으로 맞추는 것은 자연에 알려지지 않은 기능성 고분자를 생성하기 위한 가장 광범위하고 가장 생산적인 전략일 가능성이 높다.^[7]

고품질의 돌연변이 도서관 설계의 주요 난제는 최근 현저한 발전을 보여주었다. 이러한 진전은 돌연변이 하중이 단백질 특성에 미치는 영향을 더 잘 설명하는 형태였다. 또한 계산적 접근방식은 무한히 큰 시퀀스 공간에서 관리 가능한 스크린 가능한 크기로 큰 발전을 보여줌으로써 돌연변이의 스마트 라이브러리를 만들었다. 체계적인 재조합을 위한 알고리즘을 사용하여 주요 유익한 잔여물들을 식별함으로써 라이브러리 크기도 더 많은 스크린 가능한 크기로 축소되었다. 마지막으로 보다 정확한 통계적 모델과 알고리즘의 개발로 단백질 기능에 대한 결합된 돌연변이 효과를 계량하고 예측함으로써 효소의 효율적인 재공학으로 향하는 중요한 한 단계가 이루어졌다.^[8]

일반적으로 방향 진화는 단백질 돌연변이 라이브러리의 생성을 수반하는 반복적인 2단계 프로세스와 개선된 특성을 가진 변형을 선택하기 위한 높은 처리량 선별 프로세스로 요약될 수 있다. 이 기법은 단백질 구조와 기능 관계에 대한 사전 지식이 필요하지 않다. 지시된 진화는 돌연변이 단백질의 라이브러리를 생성하기 위해 무작위 또는 집중된 돌연변이 유발 물질을 이용한다. 무작위 돌연변이는 오류에 취약한 PCR 또는 사이트 포화 돌연변이 유발 중 하나를 사용하여 도입될 수 있다. 돌연변이는 또한 다수의 동질 유전자의 재조합을 사용하여 생성될 수 있다. 자연은 제한된 수의 유익한 시퀀스를 진화시켰다. 방향 진화는 새로운 기능을 가진 발견되지 않은 단백질 서열을 식별하는 것을 가능하게 한다. 이 능력은 접기나 안정성을 해치지 않고 아미노산 잔류물 대체에 내성을 갖는 단백질 능력에 달려 있다.^{[3][page needed]}

지시된 진화 방법은 크게 무성의 방법과 성적인 방법의 두 가지 전략으로 분류할 수 있다.

무성법

무성생식 방법은 부모의 유전자들 사이에 어떤 상호연계도 생성하지 않는다. 단일 유전자는 다양한 돌연변이 기법을 사용하여 돌연변이 라이브러리를 만드는 데 사용된다. 이러한 무성 생식의 방법은 무작위적 돌연변이 유발이나 집중적 돌연변이 유발의 원인이 될 수 있다.

무작위 돌연변이 유발

무작위 돌연변이 유발 방법은 관심 유전자 전체에 걸쳐 무작위로 돌연변이를 생성한다. 무작위 돌연변이 유발은 전환, 전이, 삽입, 삭제, 반전, 오감, 난센스 등 변이를 일으킬 수 있다. 무작위 돌연변이를 생성하는 방법의 예는 다음과 같다.

오류 발생 PCR

오류에 취약한 PCR은 Taq DNA 중합효소가 3'에서 5'의 엑소누클리스 활성이 부족하다는 사실을 이용한다. 이로 인해 복제당 뉴클레오티드당 0.001-0.002%의 오류율이 발생한다. 이 방법은 유전자, 즉 유전자 안의 영역을 선택하는 것으로부터 시작된다. 다음으로, 필요한 오류 범위는 자신이 발생하고자 하는 활동의 유형과 범위를 기준으로 계산한다. 이 오류 정도는 오류에 취약한 PCR 전략을 채택할지를 결정한다. PCR에 이어 이 유전자들은 플라스미드로 복제되어 유능한 세포 시스템에 도입된다. 그리고 나서 이 세포들은 원하는 특성을 위해 선별된다. 플라스미드는 개선된 특성을 보이는 군집을 위해 격리된 후 다음 단계의 돌연변이 유발물질로 사용된다. 오류에 취약한 PCR은 다른 변이에 비해 특정 변이에 대한 편견을 보여준다. 전환에 대한 편향과 같은 것.^{[3][page needed]}

PCR의 오류율은 다음과 같은 방법으로 증가할 수 있다.^{[3][page needed]}

1. 비보완적 염기쌍을 안정시키는 염화마그네슘의 농도를 높인다.
2. 염화망간을 첨가하여 염기쌍의 특이성을 감소시킨다.
3. dNTP의 증가 및 불균형 추가.
4. dITP, 8 oxo-dGTP, dPTP와 같은 기본 아날로그 추가.
5. Taq 중합효소 농도를 높인다.
6. 연장시간을 늘린다.
7. 주기 시간을 늘린다.
8. 덜 정확한 Taq 중합효소를 사용한다.

또한 자세한 내용은 중합효소 체인 반응을 참조하십시오.

롤링 서클 오류 발생 가능성이 높은 PCR

이 PCR 방법은 박테리아가 원형 DNA를 증폭시키는 방법을 본떠서 만든 롤링 서클 증폭법이다. 이 방법은 선형 DNA 이중화를 초래한다. 이 파편들은 콩카타메르라고 불리는 원형 DNA의 탠덤 반복을 포함하고 있는데, 이것은 박테리아 균주로 변형될 수 있다. 돌연변이는 먼저 목표 수열을 적절한 플라스미드로 복제함으로써 도입된다. 다음으로, 오류 발생성 롤링 원 증폭 조건 하에서 무작위 헥사머 프라이머와 φ29 DNA 중합효소를 사용하여 증폭 과정을 시작한다. 오류에 취약한 롤링 서클 증폭을 생성하기 위한 추가 조건은 템플릿 DNA 1.5 pM, 1.5 mM MnCl₂ 및 24시간 반응 시간이다. MnCl은₂ 반응 혼합물에 첨가되어 DNA 가닥의 무작위 점 변이를 촉진한다. 돌연변이 발생률은 MnCl₂ 농도를 높이거나, 템플릿 DNA 농도를 줄임으로써 증가할 수 있다. 오류 Prone 증폭은 특정 프라이머가 아닌 범용 무작위 헥사머 프라이머를 사용하기 때문에 오류 Prone 증폭에 비해 유리하다. 또한 이 증폭의 반응 산물은 끈이나 내핵으로 치료할 필요가 없다. 이 반응은 등온이다.^{[3][page needed]}

화학 돌연변이 유발

화학 돌연변이 유발은 유전적 배열에 돌연변이를 도입하기 위해 화학 물질을 사용하는 것과 관련이 있다. 화학 돌연변이들의 예는 다음과 같다.

비황산나트륨은 G/C의 풍부한 게놈 염기서열을 변형시키는데 효과적이다. 이는 비황산나트륨이 우라실(Unmethylated Cytosine)에 대한 비메틸화 시토신을 탈염시키기 때문이다.^{[3][page needed]}

에틸 메탄 설폰산 알킬라이트 구아니딘 잔류물. 이러한 변화는 DNA 복제 중에 오류를 발생시킨다.^{[3][page needed]}

질산은 아데닌과 시토신을 탈염시켜 전이를 일으킨다.^{[3][page needed]}

임의의 화학 돌연변이 유발에 대한 이중 접근은 반복적인 2단계 과정이다. 먼저 EMS를 통해 관심 유전자의 생체내 화학 돌연변이를 수반한다. 다음으로, 처리된 유전자를 분리하여 처리되지 않은 표현 벡터로 복제하여 플라스미드 백본의 돌연변이를 방지한다.^{[3][page needed]} 이 기술은 플라스미드의 유전적 특성을 보존한다.^{[3][page needed]}

돌연변이 유발에 대한 내장 배열로 글리코실라아제 타겟팅(TaGTEAM)

이 방법은 효모에서 표적형 생체내 돌연변이 유발 물질을 생성하기 위해 사용되어 왔다. 이 방법은 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제를 테트R DNA 결합 영역에 융합하는 것을 포함한다. 이는 테토 사이트를 포함하는 게놈 영역에서 돌연변이 발생률을 800회 이상 증가시키는 것으로 나타났다.^{[3][page needed]}

임의 삽입 및 삭제에 의한 돌연변이 유발

이 방법은 임의 길이의 베이스 청크를 동시에 삭제하고 삽입하여 시퀀스 길이를 변경하는 것이다. 이 방법은 새로운 제한 사이트, 특정 코돈, 비천연 아미노산용 4가지 기본 코돈의 도입을 통해 새로운 기능을 가진 단백질을 생성하는 것으로 밝혀졌다.^{[3][page needed]}

트랜스포존 기반 무작위 돌연변이 유발

최근에 트랜스포존 기반의 무작위 돌연변이 유발에 대한 많은 방법들이 보고되었다. 이 방법에는 PUMUTE-Random 원형 순열, 무작위 단백질 절단, 랜덤 뉴클레오티드 트리플트 대체, 랜덤 도메인/태그/다중 아미노산 삽입, 코돈 스캐닝 돌연변이 유발, 멀티코돈 스캐닝 돌연변이 유발 등이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 앞서 언급한 이 기술들은 모두 미니 무 트랜스포존의 설계를 필요로 한다. 써모 과학은 이 트랜스포존들의 디자인을 위한 키트를 제조한다.^{[3][page needed]}

무작위 돌연변이 유발 방법 대상 DNA 길이 변경

이 방법들은 삽입과 삭제 변이를 통해 유전자 길이를 변경하는 것을 포함한다. TRINS(tandem repeat insert, tandem repeat insert) 방식이 그 예다. 이 기법은 롤링 서클 증폭을 통해 대상 유전자의 무작위 파편에 대한 탠덤 반복이 생성되고 이러한 반복이 대상 유전자에 동시 통합된다.^{[3][page needed]}

돌연변이 균주

돌연변이 균주는 하나 이상의 DNA 복구 메커니즘이 부족한 박테리아 세포 라인이다. 돌연변이 스트랜드의 예로는 대장균 XL1-RED가 있다.^{[3][page needed]} 이 대장균의 종속 변종은 MutS, MutD, MutT DNA 복구 경로가 부족하다. 돌연변이 변이의 사용은 많은 종류의 돌연변이를 도입하는 데 유용하지만, 이러한 변종들은 변종 자체의 게놈에 돌연변이가 축적되기 때문에 문화의 점진적인 질병을 보여준다.^{[3][page needed]}

집중 돌연변이 유발

집중된 돌연변이 유발 방법은 미리 결정된 아미노산 잔류물에서 돌연변이를 발생시킨다. 이러한 기법은 관심 단백질에 대한 시퀀스-기능 관계를 이해하고 이해해야 한다. 이 관계를 이해하면 안정성, 입체도 및 촉매 효율에서 중요한 잔류물을 식별할 수 있다.^{[3][page needed]} 집중적인 돌연변이를 생성하는 방법의 예는 다음과 같다.

사이트 포화 돌연변이 유발

사이트 포화 돌연변이 유발은 단백질 기능에 중요한 역할을 하는 아미노산을 대상으로 하는 PCR 기반 방법이다. 이를 수행하는 가장 일반적인 두 가지 기술은 전체 플라스미드 단일 PCR과 중복 확장 PCR이다.

전체 플라스미드 단일 PCR은 현장 유도 돌연변이 유발(SDM)이라고도 한다.SDM 제품은 Dpn 내분비 소화를 받는다. 이 소화는 부모의 가닥만 갈라지게 되는데, 부모의 가닥은 아데닌의 N6에서 메틸화 된 GmATC를 포함하고 있기 때문이다. SDM은 10킬로바이트 이상의 큰 플라스미드에 대해서는 잘 작동하지 않는다. 또한 이 방법은 한 번에 두 개의 뉴클레오티드를 교체할 수 있을 뿐이다.^{[3][page needed]}

오버랩 익스텐션 PCR은 두 쌍의 프라이머를 사용해야 한다. 각 세트의 프라이머 1개에는 돌연변이가 포함되어 있다. 이러한 프라이머 세트를 이용한 PCR의 1라운드가 수행되고 이중 좌초 DNA 듀플렉스 2개가 형성된다. 그런 다음 두 번째 PCR 라운드가 수행되며, 이 두 가지 요소를 프라이머 세트로 다시 변성하고 아닐링하여 각 가닥이 돌연변이를 갖는 이질 듀플렉스를 생성한다. 이 새로 형성된 이질화합물의 어떤 틈새도 DNA 중합체로 채워져 더욱 증폭된다.^{[3][page needed]}

시퀀스 포화 돌연변이 유발(SeSaM)

시퀀스 포화 돌연변이 유발은 모든 뉴클레오티드 위치에서 대상 시퀀스의 무작위화를 초래한다. 이 방법은 3' 터미네이션에서 템플릿 전송을 사용하여 범용 베이스에 따라 가변 길이 DNA 조각의 생성으로 시작한다. 다음으로, 이 조각들은 하나의 좌초된 템플릿을 사용하여 전체 길이로 확장된다. 보편적 베이스는 무작위 표준 베이스로 대체되어 돌연변이를 일으킨다. 이 방법에는 세SAM-Tv-II, 세SAM-Tv+, 세SAM-III와 같은 몇 가지 변형 버전이 있다.^{[3][page needed]}

단일 프라이머 반응 병렬(SPRINP)

이 사이트 포화 돌연변이 유발 방법은 두 개의 별도 PCR 반응을 포함한다. 그 중 첫번째는 전방 프라이머만을 사용하는 반면, 두번째 반응은 후진 프라이머만 사용한다. 이것은 프라이머 다이머 형성을 방지한다.^{[3][page needed]}

메가 프라이밍 및 리가아제 프리 초점 돌연변이 발생

이 사이트 포화 돌연변이 유발 기법은 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 한 개와 범용 플랭킹 프라이머 한 개로 시작한다. 이 두 반응제는 초기 PCR 사이클에 사용된다. 이 첫 번째 PCR 사이클의 제품은 다음 PCR의 메가 프라이머로 사용된다.^{[3][page needed]}

Ω-PCR

이 사이트 포화 돌연변이 유발 방법은 중복 확장 PCR을 기반으로 한다. 그것은 원형 플라스미드에 있는 어떤 장소에서도 돌연변이를 도입하기 위해 사용된다.^{[3][page needed]}

PFunkel-minchange-OSCARR

이 방법은 단일 사이트 또는 여러 사이트에서 동시에 사용자 정의 사이트 지시 돌연변이 발생을 이용한다. OSCARR은 카세트 무작위화 및 재조합을 위한 한 냄비 단순 방법론의 약자다. 이러한 무작위화 및 재조합은 원하는 단백질 조각의 무작위화를 초래한다. 옴니칸지는 유전자에 최대 5개의 독립 코돈들을 포화시킬 수 있는 독립된 다중 사이트 포화 돌연변이 유발이다.

트리머-다이머 돌연변이 유발

이 방법은 중복된 코돈을 제거하고 코돈을 정지시킨다.

카세트 돌연변이 발생

이것은 PCR 기반의 방법이다. 카세트 돌연변이 유발은 관심 유전자가 들어 있는 DNA 카세트의 합성으로부터 시작되는데, 이 카세트는 제한 부위에 의해 양옆에 있다. 이러한 제한 장소를 가리는 엔도누클리스는 또한 대상 플라스미드의 부지를 가린다. DNA 카세트와 대상 플라스미드는 둘 다 엔도뉴클레아제로 처리되어 이러한 제한 부위를 분리하고 끈적끈적한 끝을 만든다. 다음으로 이 갈라진 틈에서 나온 제품들은 서로 묶여서 유전자가 대상 플라스미드에 삽입되는 결과를 초래한다. 카세트 돌연변이 유발물질의 대체 형태인 콤비네토리아 카세트 돌연변이 유발물질은 관심 단백질에서 개별 아미노산 잔류물의 기능을 식별하는 데 사용된다. 그런 다음 재귀적 앙상블 돌연변이 유발은 이전 결합 카세트 돌연변이 유발의 정보를 활용한다. 코돈 카세트 돌연변이 유발은 이중 좌초된 DNA의 특정 사이트에 단일 코돈을 삽입하거나 교체할 수 있게 해준다.^{[3][page needed]}

성적 방법

지시된 진화의 성적인 방법은 체내 자연 재조합을 모방하는 체외 재조합을 포함한다. 일반적으로 이러한 기술들은 부모들의 순서들 사이의 높은 순서 동질감을 요구한다. 이 기술들은 종종 두 개의 다른 부모 유전자를 재조합하는 데 사용되며, 이러한 방법들은 이 유전자들 사이에 교차하는 것을 만들어낸다.^{[3][page needed]}

시험관내 균질 재조합

동질 재조합은 체내 또는 체외 중 하나로 분류할 수 있다. 체외 균질 재조합은 체내 자연 재조합을 모방한다. 이러한 시험관내 재조합 방법은 부모의 순서 사이에 높은 순서의 호몰로지(high sequence homology를 필요로 한다. 이 기술들은 부모 유전자의 자연적 다양성을 이용하여 치메릭 유전자를 산출한다. 그 결과로 나타난 키메라는 부모의 특성이 혼합된 것을 보여준다.^{[3][page needed]}

DNA 셰플링

이 체외 기법은 재조합 시대의 최초의 기법 중 하나였다. 그것은 DNase1에 의해 동질성 부모 유전자가 작은 조각으로 소화하는 것으로 시작된다. 이 작은 조각들은 소화되지 않은 부모의 유전자에서 정화된다. 그런 다음 정제된 조각들을 프라이머리스 PCR을 사용하여 재조립한다. 이 PCR은 서로 다른 부모 유전자의 동음이의 파편들을 서로 염증하여, 치메릭 DNA를 발생시킨다. 부모 크기의 치메릭 DNA는 일반 PCR에서 엔드 터미널 프라이머를 사용하여 증폭된다.^{[3][page needed]}

시험관내 무작위 프라이밍 재조합(RPR)

이 시험관내 동질 재조합 방법은 무작위 시퀀스 프라이머를 사용하여 점 변이를 나타내는 많은 짧은 유전자 조각의 합성으로 시작한다. 이 파편들은 프라이머리스 PCR을 사용하여 전체 길이의 부모 유전자로 재조립된다. 그런 다음 이러한 재조립된 시퀀스는 PCR을 사용하여 증폭되며 추가 선택 프로세스를 거친다. 이 방법은 DNase1을 사용하지 않기 때문에 피리미딘 뉴클레오티드 옆에 재조합에 대한 편견이 없기 때문에 DNA 셰플링에 비해 유리하다. 길이도 균일하고 편향성이 부족한 합성 랜덤 프라이머를 활용하기 때문에 이 방법도 유리하다. 마지막으로 이 방법은 DNA 템플릿 순서의 길이와 무관하며, 소량의 부모 DNA를 필요로 한다.^{[3][page needed]}

잘린 메타게놈 유전자별 PCR

이 방법은 메타게놈 샘플로부터 직접 치메릭 유전자를 생성한다. 유전체 DNA 샘플로부터 기능 검사에 의해 원하는 유전자를 분리하는 것으로 시작된다. 다음으로 특정 프라이머는 서로 다른 환경 샘플에서 나온 동질 유전자를 증폭시키기 위해 설계되고 사용된다. 마지막으로, 키메릭 라이브러리는 증폭된 호몰로게이션 유전자를 섞음으로써 원하는 기능 클론을 검색하기 위해 생성된다.^{[3][page needed]}

시차 연장 프로세스(StEP)

이 체외 방법은 치메릭 유전자를 생성하기 위한 템플릿 전환에 기초한다. 이 PCR 기반 방법은 템플릿의 초기 변성으로 시작하여 프라이머를 분쇄하고 짧은 연장 시간으로 이어진다. 이후 모든 사이클은 이전 사이클에서 생성된 짧은 조각과 템플릿의 다른 부분 사이에서 어닐링을 생성한다. 이 짧은 조각들과 템플릿들은 시퀀스 상호보완성에 기초하여 함께 다듬어진다. DNA를 분해하는 이 과정은 템플릿 전환이라고 알려져 있다. 이 미늘이 벗겨진 파편들은 이후 확장을 위한 마중물 역할을 할 것이다. 이 방법은 부모의 길이에 따른 치메릭 유전자 서열을 얻을 때까지 진행된다. 이 방법을 실행하려면 측면 프리머만 시작하면 된다. Dnase1 효소도 필요 없다.^{[3][page needed]}

과도 템플릿(RACHITT)의 랜덤 키메라겐시스

이 방법은 치메릭 유전자당 평균 14개의 십자형 유전자를 가진 치메릭 유전자 라이브러리를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 그것은 부모의 위쪽 가닥에서 나온 파편들을 동질유전자에서 나온 템플릿이 들어 있는 요람의 아래쪽 가닥에 맞춰 맞추는 것으로 시작한다. 5'와 3' 오버행 플랩은 갈라지고 Pfu와 taq DNA 중합체의 엑소누클리스 및 엔도누클리스 활동에 의해 간격이 채워진다. 그런 다음, 템플릿이 포함된 요람을 요람 DNA 글코실라아제로 처리하여 헤테로듀플렉스로부터 제거한 후 PCR을 사용하여 추가 증폭한다. 이 방법은 비교적 교차 빈도가 높은 키메라를 생성하기 때문에 유리하다. 그러나 하나의 좌초된 템플릿 DNA를 포함하는 단일 좌초된 DNA와 요람의 생성의 복잡성과 필요성 때문에 다소 제한적이다.^{[3][page needed]}

합성 슈플링

합성 퇴화된 올리고뉴클레오티드의 분쇄는 최적의 코돈과 유익한 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있기 때문에 분쇄 방법에 유연성을 더한다.^{[3][page needed]}

생체내 호몰로 재조합

효모에서 수행되는 복제는 조각난 표현 벡터의 PCR 의존적 재조립을 포함한다. 이 재조립된 벡터는 효모에 도입되어 복제된다. 벡터를 복제하기 위해 효모를 사용하는 것은 대장균에서 레깅과 전파를 통해 유입될 독성과 역선택을 방지한다.^{[3][page needed]}

균질 체내 그룹화에 의한 돌연변이 조직 재조합 프로세스(MORPHING)

이 방법은 효모에 동음이의 재조합 빈도가 높은 것을 활용하여 다른 부분은 그대로 둔 채 유전자의 특정 부위에 돌연변이를 도입한다.^{[3][page needed]}

페이징 지원 연속 진화(PACE)

이 방법은 변형된 수명주기를 가진 박테리오파지를 이용하여 진화하는 유전자를 숙주로부터 숙주로 옮긴다. 페이지의 수명 주기는 전달이 효소의 관심 활동과 상관되는 방식으로 설계된다. 이 방법은 유전자의 지속적인 진화를 위해 최소한의 인간의 개입을 필요로 하기 때문에 유리하다.^[3]

시험관내 비호몰 재조합 방법

이 방법들은 단백질이 유사한 구조적 정체성을 보일 수 있는 반면 연속적인 동질성은 결여되어 있다는 사실에 근거를 두고 있다.

엑손 셔플링

엑손 셰플링은 인트론에서 일어나는 재조합 사건에 의해 다른 단백질로부터 나온 엑손들의 결합이다. 직교 엑손 슈플링은 다른 종의 직교 유전자에서 나온 엑손들을 결합하는 것을 포함한다. 직교 영역 분쇄는 다른 종의 직교 유전자에서 전체 단백질 영역을 분쇄하는 것을 포함한다. 파라로그 엑손 셰플링은 같은 종에서 온 다른 유전자의 엑손 셰플링을 포함한다. 파라로그 영역 분쇄는 동일한 종의 파라로그 단백질로부터 전체 단백질 영역을 분쇄하는 것을 포함한다. 기능적 호몰로게이션 분리는 기능적 관련이 있는 비호몰로컬 영역의 분리를 포함한다. 이 모든 과정은 치메릭 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 서로 다른 유전자로부터 원하는 엑소들을 증폭시키는 것이다. 그런 다음 이 증폭 제품은 프라이머리스 PCR을 사용하여 전체 길이 유전자로 재조립된다. 이러한 PCR 사이클 동안 조각들은 템플릿과 프라이머의 역할을 한다. 이것은 치메릭 전체 길이 유전자를 만들어 내고, 그 후 선별 검사를 받게 된다.^{[3][page needed]}

혼합 효소 생성을 위한 증분 절단(INCHY)

부모 유전자의 파편들은 엑소누클레스 III에 의해 조절된 소화를 이용하여 만들어진다. 이 파편들은 엔도누클레이즈를 사용하여 무뎌지고, 결합되어 잡종 유전자를 만들어낸다. TIOICHY는 α-인산염 dNTPs와 같은 뉴클레오티드 3인산염 아날로그를 활용한 변형된 가디지 기법이다. 이러한 뉴클레오티드의 결합은 엑소누클레스 III에 의한 소화를 막는다. exonuclease III에 의한 이러한 소화 억제를 스파이킹이라고 한다. 뾰족탑은 먼저 엑소누클레이저로 유전자를 잘라내 짧은 단 하나의 돌출부가 있는 파편을 만들어 내는 것으로 이루어질 수 있다. 이 파편들은 소량의 인산염 dNTP가 존재하는 곳에서 DNA 중합효소에 의해 증폭되는 템플릿의 역할을 한다. 그리고 나서 이 결과로 생긴 파편들은 전체 길이의 유전자를 형성하기 위해 함께 결합된다. 또는 정상적인 dNTP와 인광산염 dNTP가 있는 상태에서 PCR에 의해 온전한 부모의 유전자가 증폭될 수 있다. 그리고 나서 이 전신 증폭 제품들은 엑소누클레이저에 의해 소화된다. 소화는 엑소누클리스가 α-pdNTP와 마주칠 때까지 계속되어 다른 길이의 파편이 생길 것이다. 그리고 나서 이 파편들은 서로 결합되어 침엽수 유전자를 생성한다.^{[3][page needed]}

스크래치

이 방법은 DNA 섞임과 가렵음을 결합하여 복합 유전자의 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 두 개의 독립된 가려움 라이브러리를 구축하는 것으로 시작한다. N-terminus에 유전자 A가 있는 첫 번째 환자. 그리고 다른 하나는 N-terminus에 B 유전자를 가지고 있다. 이 혼합 유전자 파편들은 아가로오스겔 전기영동체를 통해 종단원료와 함께 제한효소 소화 또는 PCR을 사용하여 분리된다. 이 고립된 파편들은 DNase1을 사용하여 함께 혼합되고 더 나아가 소화된다. 소화된 파편들은 템플릿 스위칭으로 프라이머리스 PCR에 의해 재조립된다.^{[3][page needed]}

잘린 템플릿(RETT)의 재결합 확장

이 방법은 키메라를 위한 템플릿으로 좌초된 DNA 조각 하나가 있는 상태에서 단방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드를 템플릿으로 전환하여 하이브리드 유전자의 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 표적 mRNA로부터 역전사를 통해 단일 좌초된 DNA 파편을 준비하는 것으로 시작한다. 유전자 특정 프라이머는 단일 좌초된 DNA로 분해된다. 그리고 나서 이러한 유전자들은 PCR 사이클 동안 확장된다. 이 주기는 초기 프라이머 연장선에서 얻은 짧은 파편을 다른 단일 좌초된 DNA 파편으로 템플릿 전환 및 분리가 뒤따른다. 이 과정은 전체 길이 단 하나의 좌초된 DNA가 얻어질 때까지 반복된다.^{[3][page needed]}

시퀀스 호몰로지 독립 단백질 재조합(SHIPREC)

이 방법은 순서가 거의 없는 유전자들 사이에 재조합을 발생시킨다. 이 키메라들은 여러 개의 제한 지점을 포함하는 링커 시퀀스를 통해 융합된다. 그런 다음 DNase1을 사용하여 이 구조를 소화한다. 파편들은 S1 누클레이즈를 사용하여 무딘 끝을 만든다. 이 뭉툭한 끝 조각들은 휘장을 이용하여 원형으로 배열된다. 그런 다음 이 원형 구조물은 링커 영역에 존재하는 제한 효소를 사용하여 선형화된다. 이것은 시작구조에 비해 5'와 3'끝에 대한 유전자의 기여가 뒤바뀌는 치메릭 유전자의 라이브러리를 만드는 결과를 낳는다.^{[3][page needed]}

시퀀스 독립 사이트 방향 키메라게시스(SISDC)

이 방법은 여러 부모 유전자에서 여러 개의 십자형 유전자를 가진 유전자의 라이브러리를 만드는 결과를 낳는다. 이 방법은 부모의 유전자들 사이에서 순서 정체성을 요구하지 않는다. 이것은 모든 교차 위치에서 한 두 개의 보존된 아미노산을 필요로 한다. 그것은 부모의 순서의 정렬과 교차 사이트 역할을 하는 일치된 지역을 확인하는 것으로 시작된다. 이에 따라 제한 부위가 포함된 특정 태그를 통합한 뒤 Bac1로 소화에 의한 태그 제거로 인해 결속력이 있는 유전자가 발생한다. 이 유전자 파편들은 치메릭 도서관을 형성하기 위해 적절한 순서로 혼합되고 묶인다.^{[3][page needed]}

퇴보 호모-듀플렉스 재조합(DHR)

이 방법은 동질 유전자의 정렬에서 시작하여 다형성 영역의 식별이 뒤따른다. 다음으로 유전자의 상단 가닥은 작고 퇴화된 올리고뉴클레오티드로 나뉜다. 아래쪽 가닥은 또한 올리고뉴클레오티드로 소화되어 비계 역할을 한다. 이 파편들은 용액에 결합되어 상단의 가닥 올리고뉴클레오티드가 하단의 가닥 올리고뉴클레오티드에 조립되는 것이다. 이 파편들 사이의 틈새들은 중합효소로 채워지고 묶인다.^{[3][page needed]}

RM-PCR(Random Multi-recombinant PCR)

이 방법은 단일 PCR에서 호몰로리학 없이 복수의 DNA 조각을 섞는 것을 포함한다. 이것은 다른 구조 단위를 인코딩하는 모듈들의 조립에 의해 완전한 단백질의 재구성을 초래한다.^{[3][page needed]}

사용자 친화적 DNA 재조합(USERec)

이 방법은 우라실 dNTP를 이용하여 재조합이 필요한 유전자 파편을 증폭시키는 것으로 시작한다. 이 증폭 용액에는 프라이머, PfuTurbo, Cx Hotstart DNA 중합효소도 들어 있다. 증폭된 제품들은 다음에 USER 효소와 배양된다. 이 효소는 단일 염기쌍 간극을 만들어 내는 DNA에서 우라실 잔류물을 제거하는 촉매작용을 한다. USER 효소 처리된 파편들은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 섞이고 묶이고 Dpn1 소화를 통해 템플릿 DNA를 제거한다. 이 결과로 생긴 딩글 좌초된 파편들은 PCR을 이용하여 증폭되어 대장균으로 변형된다.^{[3][page needed]}

GGS(Golden Gate Shuffling) 재조합

이 방법은 제한 부위 외부를 절단하는 제2형 제한 효소를 사용하여 수용자 벡터에서 최소 9개의 파편을 재결합할 수 있다. Bsa1 측면 시퀀스를 양쪽에 생성하기 위해 별도의 벡터에 파편을 하위 복제하는 것으로 시작한다. 그런 다음 이 벡터는 4개의 뉴클레오티드 단일 가닥 오버행(overhang)을 생성하는 타입 II 제한 효소 Bsa1을 사용하여 분해된다. 보완적 돌출부가 있는 파편들은 T4 DNA 리게아제를 사용하여 혼합되고 결합된다. 마지막으로 이 구성품들은 표현 수준을 검사하는 대장균 세포로 변형된다.^{[3][page needed]}

인광로 티오이트 기반 DNA 재조합 방법(PRTec)

이 방법은 구조 요소 또는 전체 단백질 영역을 재결합하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 인광 다이오디제터 결합의 구체적인 구분을 가능하게 하는 인광로티오데이트 화학에 기초한다. 그 과정의 첫 단계는 벡터 백본과 함께 재조합되어야 하는 파편들의 증폭으로 시작된다. 이 증폭은 5'의 끝단에 인광산화 뉴클레오티드가 있는 프라이머를 사용하여 이루어진다. 증폭된 PCR 제품은 고온에서 에탄올 아이오딘 용액으로 분해된다. 다음으로 이 파편들은 실온에서 혼합되어 어떤 틈이라도 고치는 대장균으로 변형된다.^{[3][page needed]}

인터그론

이 시스템은 대장균의 자연적 현장 고유 재조합 시스템에 기초한다. 이 체계는 정자계라고 불리며, 자연적인 유전자 섞임을 생산한다. 이 방법은 개별 재결합 카세트 또는 trpA-E 유전자를 정자계통과 함께 전달하여 3p-definient E. coly에서 기능성 트립토판 생합성 피연산자를 구성하고 최적화하는 데 사용되었다.^{[3][page needed]}

Y-Lavigation 기반 셔플링(YLBS

이 방법은 5' 또는 3' 끝에서 단일 블록 시퀀스, 스템 루프 영역의 보완 시퀀스, PCR의 프라이머 결합 사이트 역할을 하는 D 분기 영역을 포함하는 단일 좌초된 DNA 가닥을 생성한다. 5'와 3'의 절반 가닥의 등가량이 혼합되어 줄기 부위의 상호보완성으로 인해 잡종을 형성한다. 자유인산화 5' 끝단을 3' 반 가닥으로 한 하이브리드는 0.1 mM ATP의 T4 DNA 리가아제를 사용하여 5' 반 가닥으로 자유 3' 끝을 묶는다. 묶인 제품은 두 종류의 PCR에 의해 증폭되어 5' 절반 이전과 3' 절반 이전 PCR 제품을 생성한다. 이 PCR 제품은 아비딘-바이오틴 결합을 통해 바이오틴 라벨이 부착된 스템 시퀀스를 포함하는 프리타임의 5'끝에 단일 가닥으로 변환된다. 다음으로, 다음 Y-레이징 사이클에서는 5' 반 가닥과 3' 반 가닥을 5' 반, 3' 반 가닥으로 사용한다.^{[3][page needed]}

반합리적 설계

반합리적 설계는 예측 알고리즘과 함께 단백질 순서, 구조 및 기능에 대한 정보를 사용한다. 이것들은 단백질 기능에 가장 영향을 미칠 가능성이 높은 표적 아미노산 잔류물을 식별하기 위해 함께 사용된다. 이러한 주요 아미노산 잔류물의 돌연변이는 강화된 성질을 가질 가능성이 더 높은 돌연변이 단백질의 라이브러리를 만든다.^[9]

반합성 효소 공학과 데 노보 효소 설계의 발전은 연구자들에게 생물 촉매들을 조작하기 위한 강력하고 효과적인 새로운 전략을 제공한다. 라이브러리 설계에서 시퀀스 및 구조 기반 접근법의 통합은 효소 재설계를 위한 훌륭한 지침으로 입증되었다. 일반적으로 현재의 계산 de novo 및 재설계 방법은 촉매 성능의 진화된 변종과 비교하지 않는다. 비록 실험 최적화가 유도 진화를 사용하여 만들어질 수 있지만, 설계 알고리즘의 개선으로 구조 예측의 정확성과 촉매 능력의 증대가 달성될 것이다. 단백질 역학을 통합하여 향후 시뮬레이션에 추가적인 기능 향상이 포함될 수 있다.^[9]

예측 프레임워크의 미세 조정과 함께 생화학적 및 생물물리학적 연구는 개별 설계 특징의 기능적 중요성을 실험적으로 평가하는 데 유용할 것이다. 이러한 기능적 기여를 더 잘 이해하면 미래 설계 개선에 대한 피드백을 제공할 것이다.^[9]

비록 계산 단백질 설계가 단백질 공학이 생체 고분자를 조작할 수 있는 방법을 근본적으로 바꾸어 놓았지만, 방향 진화는 단백질 공학의 선택 방법으로 대체되지는 않을 것 같다. 가설 기반 단백질 공학을 위한 예측 프레임워크를 통합하는 방법을 사용하여 더 작고, 더 집중적이고, 기능적으로 풍부한 라이브러리를 생성할 수 있다. 새로운 설계 전략과 기술적 진전은 초점화된 도서관에서 최고 성과를 내는 후보들을 식별하는 가장 효과적인 전략을 나타내는 지시된 진화 같은 전통적인 프로토콜에서 출발하기 시작했다. 도서관 전체를 통합하는 것은 도서관 준비를 위한 셔플링과 돌연변이 유발 프로토콜을 대체하고 있다. 또한 수백만 명의 후보자들의 기념비적인 심사 및 선발 노력을 대신하여 고도로 구체적인 저처리량 심사 평가가 점점 더 많이 적용되고 있다. 이와 함께, 이러한 발전은 단백질 공학을 지시된 진화를 넘어 실용적이고 효율적인 생물 촉매 맞춤화 전략을 지향할 태세다.^[9]

선별 및 선정 기법

단백질이 지시 진화, 배급 설계 또는 반연산 설계를 거친 후에는 돌연변이 단백질의 라이브러리를 선별하여 어떤 돌연변이가 강화된 특성을 보이는지 판단해야 한다. 페이지 표시 방법은 단백질을 검사하는 한 가지 옵션이다. 이 방법은 변형 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자와 페이지코트 단백질 유전자의 결합을 포함한다. 페이징 표면에 표현된 단백질 변형은 시험관내 고정 표적과 결합하여 선택한다. 선택된 단백질 변형이 있는 페이지는 박테리아에서 증폭되고, 이어 효소와 연계된 면역항암제 검사에 의한 양성 복제의 식별이 뒤따른다. 이 선택된 페이지는 DNA 염기서열의 적용을 받는다.^{[3][page needed]}

세포표면 디스플레이 시스템은 돌연변이 폴리펩타이드 라이브러리를 선별하는 데도 활용될 수 있다. 도서관 돌연변이 유전자는 표현 벡터에 통합되어 적절한 숙주세포로 변환된다. 이러한 호스트 셀은 원하는 표현형 세포를 식별하기 위해 추가적으로 높은 처리량 선별 방법을 받는다.^{[3][page needed]}

세포 자유 표시 시스템은 체외 단백질 번역이나 세포 자유 번역을 이용하기 위해 개발되었다. 이러한 방법에는 mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 공밸런스 및 비공밸런스 DNA 디스플레이, 시험관내 구획화가 포함된다.^{[3]: 53}

효소공학

효소공학이란 효소의 구조(따라서 그 기능)를 수정하거나 격리된 효소의 촉매 활성도를 수정하여 새로운 대사물을 생산하거나, 반응을 위한 새로운 (분석된) 경로를 허용하거나,^[10] 일부 특정 화합물에서 다른 화합물로 변환(생물학적 형성)하는 것을 응용하는 것이다. 이 제품들은 화학약품, 의약품, 연료, 식품 또는 농업용 첨가물로 유용하다.

효소 원자로는 효소 수단에 의한 원하는 변환을 수행하는 데 사용되는 반응성 매체를 포함하는 용기로 구성된다. 이 과정에서 사용되는 효소는 용액에서 자유롭다.

공학적 단백질의 예

Top7이라는 이름의 새로운 접이식 단백질과 부자연스러운 분자를 위한 센서를 디자인하기 위해 컴퓨터 방법이 사용되어 왔다.^[12][13] 핵융합 단백질 공학은 식품의약국(FDA)의 크라이오피린 관련 주기증후군 치료 승인을 확보한 제약사인 라일론셉트를 생산했다.

또 다른 컴퓨팅 방법인 IPRO는 칸디다 보이디니 xylose reducedactase의 공동 인자 고유성의 전환을 성공적으로 설계했다.^[14] 반복 단백질 재설계 및 최적화(IPRO)는 단백질을 재설계하여 고유하거나 새로운 기판과 공동 인자(co factor)를 증가시키거나 특정성을 부여한다. 이는 특정 설계 위치 주변의 단백질 구조를 무작위로 반복적으로 교란시켜 로타머의 가장 낮은 에너지 조합을 식별하고 새로운 설계가 이전 설계보다 결합 에너지가 더 낮은지 여부를 판단함으로써 이루어진다.^[15]

연산 보조 설계는 또한 고도로 순서가 정해진 나노단백질 어셈블리의 복잡한 특성을 설계하기 위해 사용되어 왔다.^[16] 두 개의 과점 상태를 채움으로써 구조적 불안정성과 불완전한 자기 조립 행동을 자연스럽게 보여주는 단백질 케이지, 대장균 박테리오페리틴(EcBfr)이 본 연구의 모델 단백질이다. 계산 분석과 호몰로그램과의 비교를 통해, 이 단백질은 주로 두 개의 물교합 아스파라긴 잔류물을 중심으로 한 계면수 포켓이 존재하기 때문에 2배 대칭축에 평균보다 작은 조광체 인터페이스를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 수정된 구조적 안정성을 위해 EcBfr을 엔지니어링할 수 있는 가능성을 조사하기 위해, 야생형 EcBfr에 상대적인 조광체 인터페이스에서 480개의 가능한 돌연변이들의 에너지 차이를 가상으로 탐구하기 위해 반감기 계산법을 사용한다. 이 계산 연구도 물다리의 아스파라긴에 수렴한다. 이 두 아스파라긴을 소수성 아미노산으로 대체하면 알파헬리컬 단모세포로 접히는 단백질이 생겨 원형 이분법과 전송전자현미경 검사에서 입증된 바와 같이 우리에 결합하게 된다. 열과 화학적 변성 모두 계산과 일치하여 재설계된 모든 단백질이 증가된 안정성을 가지고 있음을 확인한다. 세 가지 돌연변이 중 하나는 크기 제외 크로마토그래피와 고유 젤 전기식 둘 다에서 보여지듯이 용해에서 더 높은 순위의 과점 상태에 찬성하는 모집단을 이동시킨다.^[16]

실리코 방식인 포레디자이너는 박테리아 채널 단백질(OmpF)을 재설계해 1nm 크기의 모공 크기를 원하는 서브nm 치수로 줄이는 데 성공했다.^[17] 가장 좁게 설계된 모공에 대한 운반 실험에서 생체모방 블록 폴리머 매트릭스에서 조립했을 때 완전한 소금 제거가 나타났다.

참고 항목

참조

외부 링크

• WHAT IF 소프트웨어 기반 단백질 엔지니어링 및 관련 주제용 서버
• Scratch에서 제조된 효소 - 연구자들은 새로운 계산 기법, 기술 리뷰, 2008년 3월 10일자로 이전에는 볼 수 없었던 촉매들을 엔지니어링한다.