단백질 방법

Protein methods
DNA 또는 RNA에 대한 방법은 핵산 방법을 참조하십시오.

단백질 방법은 단백질을 연구하는 데 사용되는 기술이다.단백질을 연구하기 위한 실험적인 방법(예를 들어, 단백질 검출, 단백질 분리 및 정제, 단백질의 구조와 기능 특성화 등)이 있다.계산 방법은 일반적으로 단백질을 분석하기 위해 컴퓨터 프로그램을 사용합니다.그러나 많은 실험 방법(예: 질량 분석)은 원시 데이터의 계산 분석을 필요로 한다.

유전적 방법

단백질의 실험적 분석은 전형적으로 단백질의 발현과 정화를 필요로 한다.관심 단백질을 코드하는 DNA를 조작함으로써 발현을 달성한다.따라서, 단백질 분석은 보통 DNA 방법, 특히 복제를 필요로 한다.유전자 방법의 예로는 개념 번역, 부위 지향 돌연변이 유발, 융합 단백질 사용, 질병 상태와 대립 유전자 매칭 등이 있다.그러나 일부 단백질은 개념적 번역으로 알려진 방법에 의해 알려진 mRNA 배열에서 코돈을 아미노산으로 변환함으로써 직접적으로 배열된 적이 없다.(유전자 코드 참조).부위 지향적 돌연변이 유발은 단백질의 구조를 변화시키는 돌연변이를 선택적으로 도입한다.단백질의 일부 기능은 이러한 변화의 결과로 표현형의 변화를 연구함으로써 더 잘 이해할 수 있다.융합 단백질은 추적하기 쉬운 변형 단백질을 생산하기 위해 His-tag와 같은 단백질 태그를 삽입함으로써 만들어진다.예를 들어 GFP-Snf2H는 녹색 형광 단백질에 결합된 단백질로 구성되어 하이브리드 단백질을 형성한다.DNA 대립 유전자를 분석함으로써 LOD 점수 계산과 같이 질병 상태와 관련된 것을 식별할 수 있다.

조직으로부터의 단백질 추출

견고한 세포 외 매트릭스(생검 검체, 정맥 조직, 연골, 피부 등)를 가진 조직으로부터 단백질을 추출하는 것은 종종 액체 질소의 충격 분쇄에 의해 실험실 환경에서 이루어진다.샘플은 액체 질소에 동결된 후 충격 또는 기계적 연삭을 거칩니다.이 온도에서 샘플의 물은 매우 취약해지기 때문에 샘플은 종종 미세 조각 집합으로 환원되고, 그 후 단백질 추출을 위해 용해될 수 있습니다.조직 분쇄기로 알려진 스테인리스 스틸 장치가 이러한 목적으로 사용되기도 합니다.

이러한 장치의 장점은 작고 가치 있는 샘플에서 높은 수준의 단백질을 추출하는 것이며, 단점은 낮은 수준의 교차 오염입니다.

단백질 정제

단백질 검출

단백질 고분자의 크기가 상당히 작기 때문에 알려지지 않은 단백질 샘플의 식별과 정량화가 특히 어렵습니다.이 과정을 단순화하기 위해 단백질을 정량화하기 위한 몇 가지 신뢰할 수 있는 방법이 개발되었습니다.이러한 방법에는 Warburg-Christian 방법, Lowry 검사 및 Bradford 검사(모두 고분자의 흡광도 특성에 의존함)가 포함됩니다.

Bradford 분석법은 단백질에 결합하기 위해 염료를 사용한다.가장 일반적으로는 쿠마시에 밝은 파란색 G-250 염료가 사용됩니다.단백질이 없을 때는 빨간색이지만 단백질과 결합하면 파란색으로 변한다.염료-단백질 복합체는 파장 595나노미터에서 최대 빛을 흡수하며 1 ug에서 60 ug 사이의 샘플에 민감합니다.Lowry 및 Warburg-Christian Methods와 달리 Bradford assays는 단백질의 Tryptophan 및 Tyrosine 함량에 의존하지 않으므로 보다 정확한 방법을 가정할 수 있습니다.

Lowry assay는 biuret assay와 유사하지만 정량화에 더 정확한 Folin 시약을 사용합니다.폴린 시약은 산성 조건에서만 안정적이며, 이 방법은 검사된 단백질에 트립토판과 티로신이 얼마나 존재하느냐에 따라 왜곡 결과에 민감하다.Folin 시약은 트립토판과 티로신에 결합하며, 이는 두 아미노산의 농도가 방법의 민감도에 영향을 미친다는 것을 의미한다.이 방법은 Bradford 방법과 유사한 농도 범위에서 민감하지만 적은 양의 단백질이 더 필요합니다.

Warburg – Christian 방법은 자연적으로 발생하는 흡광도 범위에서 단백질을 선별한다.대부분의 단백질은 트립토판과 티로신이 존재하기 때문에 280나노미터로 빛을 매우 잘 흡수하지만, 이 방법은 트립토판과 티로신이 의존하는 아미노산의 양에 따라 달라집니다.

각 메서드에 대한 자세한 계정에 링크된 추가 메서드가 아래에 나열되어 있습니다.

총 단백질만 검출하는 비특이적 방법

  • 흡광도: 280 또는 215 nm에서 판독하십시오.매우 부정확할 수 있습니다.검출은 100μg/mL~1mg/mL 범위이다.260/280에서 측정한 흡광도 측정값의 비율은 검체의 순도/오염을 나타낼 수 있습니다(순도 검체의 비율은 0.8 미만).
  • Bradford 단백질 분석:약 1mg/m 범위에서 검출l
  • 비우레 테스트 파생 평가:
  • 플루오레스카민:아미노산에 1차 아민이 존재하는 경우 용액 중 단백질과 펩타이드를 정량화한다.
  • 아미도 블랙:1~12μg/m 범위에서의 검출l
  • 콜로이드 골드:검출 범위는 20~640ng/ml
  • 질소 검출:
    • Kjeldahl 방법: 주로 식품에 사용되며 재료의 산화가 필요합니다.
    • 듀마법 : 주로 식용으로 사용되며 재료 연소가 필요함

단일 단백질의 양을 검출할 수 있는 특정 방법

단백질 구조

단백질과 관련된 상호작용

단백질-단백질 상호작용

단백질-DNA 상호작용

단백질-RNA 상호작용

계산 방법

기타 방법

「 」를 참조해 주세요.

참고 문헌

  • 다니엘 M. 볼락, 마이클 D.로지키와 스튜어트 J. 에델스타인.(1996.)Wiley Publishers, Protein Methods, 2 Ed. ISBN0-471-11837-0.

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