시간 분해형 형광 에너지 전달

Time-resolved fluorescence energy transfer

시간 분해형 형광 에너지 전달(TR-FRET)은 시간 분해형 형광 측정(TRF)과 Förster 공명 에너지 전달(FRET)의 실용적인 조합으로, 약물 발견 연구자들에게 강력한 도구를 제공한다.TR-FRET은 TRF의 낮은 백그라운드 측면과 FLET의 균질 분석 형식을 결합합니다.그 결과 분석 결과 처리량이 증가하고 잘못된 양성/거짓 음성 결과가 줄어들 뿐만 아니라 유연성, 신뢰성 및 민감도가 향상됩니다.FRET에는 2개의 형광체(공여체와 수용체)[1]가 포함되어 있습니다.에너지원(예: 플래시 램프 또는 레이저)에 의한 도너의 들뜸에 의해 리셉터로의 에너지 전달이 발생합니다.리셉터는 그 특징적인 파장에서 빛을 방출합니다.

이 기술의 FLET 측면은 스펙트럼 오버랩 및 관련된 형광체의 근접성을 포함한 여러 요인에 의해 구동되며, 이 경우 에너지 전달은 도너와 수용체 사이의 거리가 충분히 작을 때만 발생합니다.실제로, FLET 시스템은 FLET 효율이 50%인 형광체 사이의 거리인 Förster 반지름0(R)에 의해 특징지어집니다.많은 FLET 형광체 쌍의 경우,[1] R은0 사용된 수용체와 분석 내 형광체의 공간 배열에 따라 20 ~ 90Ω 사이에 있습니다.이 에너지 전달 측정을 통해 각 파트너와 형광 라벨을 결합하여 에너지 전달 수준을 검출함으로써 생체 분자 간의 상호작용을 평가할 수 있다.에너지 전달의 척도로서의 수용체 방출은 결합되지 않은 검사 구성 요소(예: 여과 또는 세척 단계)에서 분리할 필요 없이 검출할 수 있으므로 검사 시간과 [2]비용이 절감됩니다.

이점

균질한 혼합 판독 TR-FRET 측정법은 형광 편광([3]FP) 또는 TRF 측정과 같은 다른 생체 분자 선별 측정보다 장점을 제공합니다.FP 분석에서는 라이브러리 화합물에 의한 백그라운드 형광은 일반적으로 탈분극되며 산란광(예: 침전 화합물)에 의한 백그라운드 신호는 일반적으로 편광된다.검사 구성에 따라 두 경우 모두 잘못된 양성 또는 잘못된 음성 결과를 초래할 수 있습니다.그러나 TR-FRET 어세이에서 사용되는 공여종은 백그라운드 형광 또는 산란광보다 몇 배 긴 형광수명을 가지기 때문에 간섭신호가 완전히 소멸된 후에 에너지 전달에 의한 방출신호를 측정할 수 있다.TR-FRET 어세이에서는 (FP 어세이와는 달리) 제한 수용체 및 과도한 트레이서 농도를 사용하도록 포맷할 수도 있습니다.이것에 의해, 한층 더 코스트를 [4]삭감할 수 있습니다.TRF 검사의 경우 검사의 활성 신호를 측정하기 전에 결합되지 않은 형광 시약을 제거하기 위한 세척 단계가 필요합니다.따라서 시약 사용량과 검사 완료 시간이 증가하고 시스템을 소형화하는 기능이 제한됩니다(예: 384웰 마이크로미터 플레이트에서 1536웰 [5]플레이트로 변환).TR-FRET 검사는 신호 생성을 위해 기증자와 수용체 종의 필요한 근접성을 활용합니다.

또한, 이 방법은 검출될 신호를 생성하기 위해 방사성 물질에 의존하지 않기 때문에 일부 연구자들에 의해 선호된다.이를 통해 자재 사용에 따른 위험과 보관, 사용 및 [6]폐기에 따른 비용 및 물류 비용을 모두 피할 수 있습니다.

구성 요소들

TR-FRET은 다양한 불소단 조합으로 달성할 수 있지만 랜턴 금속이 특히 유용합니다.특정 생명과학 애플리케이션은 란타니드 이온 복합체(Ln(II) 킬레이트 또는 크립토산염)의 고유한 형광 특성을 활용합니다.이는 기존 형광체(예: 플루오레세인, 알로피코야닌, 피코에리스린 및 로다민)에 비해 Stokes 이동이 크고 배출 수명(마이크로초에서 밀리초)이 매우 길기 때문에 이 용도에 적합하다.이러한 연구에 일반적으로 사용되는 생물학적 액체 또는 혈청은 자연적으로 형광을 띠는 많은 화합물과 단백질을 포함하고 있다.따라서 기존의 정상 상태 형광 측정을 사용하면 검사 민감도에 심각한 제한이 있습니다.란타니드와 같은 긴 수명의 형광체와 시간 분해 검출(여기와 방출 검출 사이의 지연)을 조합하여 신속한 형광 간섭을 최소화합니다.이 방법(일반적으로 시간 분해 형광 측정(TRF)이라고 함)에는 두 개의 형광체, 즉 공여체와 수용체가 포함됩니다.에너지원(예: 플래시 램프 또는 레이저)에 의한 공여 불소 포자(이 경우 란타니드 이온 복합체)의 들뜸은 서로 주어진 근접(Förster 반지름) 내에 있는 경우 수용체 불소 포자로의 에너지 전달을 생성한다.수용체 형광체는 그 특징적인 파장에서 빛을 방출합니다.생명과학 어세이에서 가장 일반적으로 사용되는 두 개의 란타니드는 해당 수용체 염료, 그리고 이들의 들뜸 및 방출 파장 및 결과 스토크스 시프트(여기와 방출 파장의 분리)와 함께 아래에 나와 있습니다.

공통 랜타니드 기증자-수용체 쌍

기증자[7] 들뜸 † 방출 † (nm) 수용자 들뜸 † 방출 † (nm) 스토크스 시프트(nm)

(입자 들뜸 accept 수용체 방출)

유로피움3+ 340⇒615 알로피코시아닌 615⇒660 320
터비움3+ 340⇒545 피코에리스린 545⇒575 235

TR-FRET의 예

일부 TR-FRET 측정에서 가능한 파장의 분리를 설명하기 위해 스토크스 이동 및 들뜸 및 방출 파장으로 라벨이 부착된 유로피움 및 알로피코시아닌의 들뜸 및 방출 프로파일의 스펙트럼 오버레이.

상기 표에서 기술한 바와 같이 유로피움에서 알로피코시아닌으로의 형광 에너지 전달은 특히 생체 분자 선별 분석에서 시간 분해 방식으로 사용될 수 있다.오른쪽 그림은 유로피움과 알로피코시아닌(APC) 들뜸의 교차점을 나타내고 있으며, 유로피움과 APC가 생체 분자 상호작용을 통해 근접할 때 에너지 전달이 일어난다.

이 두 개의 형광체가 생체 분자 상호작용에 의해 결합될 때, 들뜸 동안 유로피움이 포착한 에너지의 일부는 620 nm의 형광 방출을 통해 방출되고, 나머지 에너지는 APC로 전달됩니다.이 에너지는 665 nm의 특정 형광으로 APC에 의해 유로피움과의 FLET를 통해서만 방출된다.

High-throughput 스크리닝 어세이 설계를 통해 소재가 혼합되며, 효소가 펩타이드에 작용하면 모든 성분이 각각의 타깃에 결합되어 FRET가 발생합니다.[8]

그런 다음 계측기는 들뜸 신호와 방출 신호 사이의 '크로스 토크'를 제거하기 위해 입사/여진 빛(기증 분자를 자극하기 위해 계측기가 공급하는 빛 에너지 펄스) 이후 방출된 빛의 판독을 수백 밀리초 지연시킵니다(이 경우 '크로스 토크').는 스펙트럼 프로파일이 중복되는 것을 말하며, 이는 검사 설계에 따라 오양성, 오검출 또는 감도 감소를 초래할 수 있습니다.[9]이 과정은 검사의 '시간 분해' 측면으로 구성됩니다.

레퍼런스

  1. ^ a b Yan, Y (2003). "Analysis of protein interactions using fluorescence technologies". Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5): 635–640. doi:10.1016/j.cbpa.2003.08.017. ISSN 1367-5931.
  2. ^ Periasamy, Ammasi (2005). Molecular Imaging: FRET Microscopy and Spectroscopy (Methods in Physiology Series). Academic Press. p. 336. ISBN 978-0195177206.
  3. ^ Piston, David W.; Kremers, Gert-Jan (2007). "Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly". Trends in Biochemical Sciences. 32 (9): 407–414. doi:10.1016/j.tibs.2007.08.003. ISSN 0968-0004. PMID 17764955.
  4. ^ Fu, Haian (2004). Protein-Protein Interactions: Methods and Applications. Humana Press, Inc. p. 544. ISBN 978-1588291202.
  5. ^ Glickman, J. Fraser; Xiang Wu; Robert Mercuri; Chantal Illy; Benjamin R. Bowen; Yang He; Matthew Sills (2002). "A Comparison of ALPHAScreen, TR-FRET, and TRF as Assay Methods for FXR Nuclear Receptors". J Biomol Screen. 7 (1): 3–10. doi:10.1177/108705710200700102. PMID 11897050.
  6. ^ Sadler, T. M.; Achilleos, M.; Ragunathan, S.; Pitkin, A.; LaRocque, J.; Morin, J.; et al. (2004). "Development and comparison of two nonradioactive kinase assays for I kappa B kinase". Anal Biochem. 326 (1): 106–13. doi:10.1016/j.ab.2003.11.021. PMID 14769342.
  7. ^ Gschneidner Jr., Karl A. (2007). Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths, Volume 37: Optical Spectroscopy. North Holland. p. 558. ISBN 978-0444521446.
  8. ^ Degorce, Francois (2009). "HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery - A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications". Current Chemical Genomics. 3 (1): 22–32. doi:10.2174/1875397300903010022. ISSN 1875-3973. PMC 2802762. PMID 20161833.
  9. ^ Thews, Elmar; Margarita Gerken; Reiner Eckert; Johannes Zäpfe; Carsten Tietz; Jörg Wrachtrup (2005). "Cross Talk Free Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy in Live Cells". Biophysical Journal. 89 (3): 2069–2076. Bibcode:2005BpJ....89.2069T. doi:10.1529/biophysj.104.057919. PMC 1366709. PMID 15951373.