차간섭 조영 현미경법

Differential interference contrast microscopy
투과된 DIC 현미경으로 촬영된 Micrasterias furcata
150×Nomarski 현미경법 하에서 LiNbO에3 의한 광학적 손상

DIC(Differential Interference Contrast) 현미경은 Nomarski Interference Contrast(NIC) 또는 Nomarski 현미경으로도 알려져 있으며, 투명하지 않은 샘플의 콘트라스트를 높이기 위해 사용되는 광학 현미경 기술입니다.DIC는 간섭계 원리에 따라 샘플의 광경로 길이에 대한 정보를 얻고 그렇지 않으면 보이지 않는 특징을 확인할 수 있습니다.비교적 복잡한 광학 시스템은 회색 배경에 흑백으로 보이는 물체를 가진 이미지를 생성한다.이 이미지는 위상 대비 현미경으로 얻은 것과 비슷하지만 밝은 회절 후광은 없습니다.이 기술은 [1]1952년 폴란드의 물리학자 조르주 노마르스키에 의해 개발되었다.

DIC는 편광된 광원을 시료 평면에서 공간적으로 변위(전단)되고 관찰 전에 재결합되는 두 개의 직교 편광 상호 간섭성 부분으로 분리하여 작동합니다.재결합 시 두 부분의 간섭은 광학 경로 차이(굴절률 및 기하학적 경로 길이 곱)에 민감하다.샘플의 제로 광로차에서 간섭을 결정하는 조정 가능한 오프셋 위상을 추가하면 대비는 전단방향을 따른 경로 길이 구배에 비례하여 샘플의 광학적 밀도 변화에 대응하는 3차원 물리적 릴리프의 외관을 제공한다.지형적으로 정확한 이미지를 제공하지 않습니다.

광경로

1. 편광되지 않은 빛은 현미경으로 들어가 45°에서 편광됩니다.

이 기술이 작동하려면 편광광이 필요합니다.

2. 편광은 제1의 노마르스키 변성 월라스톤 프리즘에 입사하여 서로 90° 편광된 두 개의 광선, 즉 샘플링 광선과 기준 광선으로 분리된다.

울라스톤 프리즘은 빛의 편광에 따른 굴절률의 변화로 인해 편광에 따라 빛을 분할하는 석영과 같은 결정성 물질의 두 층으로 이루어진 프리즘의 일종이다.노마르스키 프리즘은 두 개의 광선이 프리즘 본체 바깥의 초점에 도달하도록 하기 때문에 프리즘의 초점을 활발하게 맞출 수 있기 때문에 현미경을 설치할 때 유연성이 높아집니다.

3. 2개의 광선은 시료를 통과시키기 위해 응축기에 의해 집속된다. 이 두 개의 광선은 약 0.2μm 간격으로 표본의 인접한 두 지점을 통과하도록 초점이 맞춰집니다.

샘플은 0° 편광과 90° 편광의 두 가지 간섭성 광원에 의해 효과적으로 조명된다.그러나 이 두 개의 조명은 서로 약간 오프셋된 상태로 정렬되어 있지 않습니다.
DIC 현미경을 통한 빛의 경로.두 개의 조명 빔이 콘덴서와 대물 사이에 평행해야 합니다.

(4) 광선은 시료의 인접 영역을 통과하며, 전단부에 의해 분리된다. 분리는 일반적으로 현미경의 분해능과 유사합니다. 굴절률이나 두께가 다른 영역의 광로 길이를 경험합니다. 이는 광학적으로 밀도가 높은 물질에서 발생하는 파동에 의해 발생하는 지연으로 인해 한 광선의 다른 광선에 대한 위상 변화를 일으킨다.

샘플의 인접 지점 쌍(및 샘플에 의한 흡수율, 굴절 및 산란)을 통과하는 많은 광선의 쌍은 이제 샘플의 이미지가 0° 및 90° 편광 빛에 의해 전달된다는 것을 의미한다.이러한 이미지는 개별적으로 보면 샘플의 밝은 필드 이미지이며 서로 약간 오프셋됩니다.빛은 또한 인간의 눈에 보이지 않는 이미지, 즉 빛의 위상에 대한 정보를 전달한다.이건 나중에 꼭 필요해.서로 다른 편광으로 인해 이 두 이미지 간의 간섭이 방지됩니다.

5. 광선은 대물렌즈를 통과하여 두 번째 노마스키 변형 월라스톤 프리즘에 초점을 맞춥니다.

6. 두 번째 프리즘은 두 개의 광선을 135°에서 편광된 하나의 광선으로 재결합한다. 광선의 조합은 광 경로 차이에 따라 해당 지점에서 영상을 간섭, 밝기 또는 어둡게 만듭니다.

이 프리즘은 두 개의 밝은 필드 이미지를 겹쳐서 간섭할 수 있도록 편광을 정렬합니다.그러나 조명의 오프셋 때문에 이미지가 제대로 정렬되지 않습니다. 즉, 시료의 같은 지점을 통과한 2개의 광선 간에 간섭이 발생하는 대신 인접한 지점을 통과한 광선 간에 간섭이 발생하므로 위상이 약간 다릅니다.위상 차이는 광로 길이의 차이에 기인하기 때문에 이 빛의 재조합은 광로 길이의 "광학적 미분화"를 일으켜 보이는 이미지를 생성한다.

이미지

DIC 현미경에서의 이미지 생성 과정

이미지는 매우 비스듬한 조명 아래 3차원 물체의 모습을 하고 있어 해당 얼굴에 강한 명암을 일으킵니다.외관 조명의 방향은 Wollaston 프리즘의 방향으로 정의됩니다.

위에서 설명한 바와 같이, 이미지는 동일한 두 개의 밝은 필드 이미지가 서로 약간 오프셋(일반적으로 약 0.2μm)되어 있으며 위상차이에 의한 후속 간섭이 위상 변화(및 광로 길이)를 가시적인 어둠의 변화로 변환하여 생성됩니다.이러한 간섭은 건설적이거나 파괴적일 수 있으며, 3차원의 특성을 발생시킵니다.

간섭을 일으키는 일반적인 위상차는 매우 작으며 90°(파장의 1/4)보다 큰 경우는 거의 없습니다.이는 대부분의 샘플과 샘플이 속한 매질의 굴절률 유사성 때문입니다. 예를 들어 물 속의 셀은 굴절률 차이가 0.05 정도밖에 나지 않습니다.이 작은 위상차는 DIC의 올바른 기능에 중요합니다. 두 물질 사이의 접합부의 위상차가 너무 크면 위상차가 180°(파장의 절반)에 도달하여 완전한 파괴 간섭과 비정상적인 암흑 영역이 발생할 수 있기 때문입니다. 위상차가 360°(전체 파장)에 도달하면)는, 완전한 건설적인 간섭을 일으켜, 비정상적으로 밝은 영역을 형성합니다.

이미지는 시료를 따라 시료를 가로지르는 위치에 대한 광학 경로 길이의 차이로서 근사치(샘플 및 빔 분리의 분해능 한계로 인한 굴절 및 흡수를 무시함)할 수 있으며, 따라서 시료의 굴절률(광학적 밀도)의 차이입니다.

오프셋0 페이즈가 다른 DIC 이미지 »

대비를 조정하려면 오프셋 위상을 사용합니다.대상의 Nomarski 프리즘을 변환하거나 편광자와 콘덴서 Normarski 프리즘(De-Senarmont Compensation) 사이의 람다/4 파형 플레이트를 사용합니다.그 결과 나타나는 대비는 0 위상 오프셋(전단 차분의 제곱에 비례하는 강도)을 위한 암시장에서 5~90도의 위상에 대해 볼 수 있는 일반적인 릴리프(delief)로, 소멸된 파장이 위상 차이에 따라 변화하는 360도의 광학 염색으로 이어진다.

순차적으로 시프트된 영상을 조합할 때 객체에 의해 도입된 위상 시프트가 원치 않는 비간섭적 아티팩트와 분리될 수 있으며, 이는 특히 탁한 [2]샘플에서 대조적인 개선을 가져옵니다.

적용들

DIC의 투명한 입방체의 방향별 영상
Nomarski DIC에서 부분적으로 개발된 포토 레지스트

DIC는 조직 배양물 또는 개별 수분이 운반하는 단세포 유기체의 도말과 같은 살아있는 및 비유지 생물학적 샘플을 촬영하는 데 사용됩니다.이러한 조건에서의 해상도와[specify] 선명도는 표준 광학 현미경 기술 중에서 타의 추종을 불허합니다.

Nomarski DIC에서 볼 수 있는 알루미늄-실리콘 합금 피트
Nomarski DIC에 부분적으로 식각된 이산화규소

DIC가 사용되는 비생물학적 영역 중 하나는 평면 실리콘 반도체 공정 분석이다.실리콘 처리의 얇은 필름(일반적으로 100~1000 nm)은 가시광선(이산화실리콘, 질화실리콘, 다결정실리콘 등)에 대해 대부분 투명하며, 그 위에 결함이나 오염이 더 뚜렷하게 나타납니다.또한 피쳐가 기판 재료의 피트인지, 위에 이물질이 있는지 확인할 수 있습니다.식각된 결정성 특징은 DIC에서 특히 두드러지게 나타납니다.

적절한 조건에서 사용할 경우 영상 화질은 해상도가 뛰어나며 위상 대비와 달리 거의 모든 아티팩트가 없습니다.그러나 DIC 영상의 분석은 항상 Wollaston 프리즘의 방향과 외관 조명 방향을 고려해야 합니다. 이와 평행한 특징은 표시되지 않습니다.그러나 이는 샘플을 회전시키고 영상의 변화를 관찰하는 것만으로 쉽게 극복할 수 있습니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Lang, Walter (1968). "Nomarski differential interference-contrast microscopy" (PDF). ZEISS Information. 70: 114–120. Retrieved 31 August 2016.
  2. ^ Nguyen, T.H.; Kandel, M.E.; Rubessa, M.; et al. (2017). "Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens". Nat Commun. 8 (210): 210. Bibcode:2017NatCo...8..210N. doi:10.1038/s41467-017-00190-7. PMC 5547102. PMID 28785013.
  • Murphy, D., DIC(Differential Interference Contrast) 현미경 검사 및 변조 조영 현미경 검사(Fundamentals of Light Microscopy and Digital Imaging, New York, Wiley-Liss, 153–168페이지(2001).
  • Salmon, E. and Tran, P., 고해상도 비디오 강화 차분 간섭 대비(VE-DIC) 광 현미경, 비디오 현미경, G. 및 Wolf, D. (eds), 뉴욕 학술 출판부, 페이지 153–184(1998).
  • 차동 간섭 대비 - 참조

외부 링크

라이브러리 리소스 정보
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