삼광자 현미경법

3광자 현미경(3PEF)은 비선형 들뜸 ^[1][2][3]효과에 기초한 고해상도 형광 현미경이다.두 개의 광자 들뜸 현미경과 달리 세 개의 광자를 사용합니다.일반적으로 1300 nm 이상의 파장 레이저를 사용하여 동시에 흡수된 광자 3개로 형광 염료를 자극합니다.형광 염료는 에너지가 각 입사 광자의 에너지보다 3배(약간 더 작음)인 하나의 광자를 방출한다.2광자 현미경에 비해,three-photon 현미경은 초점 면에서 훨씬 빨리 그 2광자 현미경보다 1/z4{\displaystyle 1/z^{4}}에 의해 게다가,three-photon 현미경 덜 tissu과near-infrared 빛을 고용합니다 1/z2{\displaystyle 1/z^{2}}.[4]에 의해 형광 물질을 감소시킨다.e산란 효과이것은 세 개의 광자 현미경을 기존의 현미경보다 더 높은 분해능으로 만든다.

개념.

3광자 들뜸 형광은 1964년 싱과 브래들리가 나프탈렌 ^[5]결정의 3광자 흡수 단면을 추정했을 때 처음 관찰되었습니다.1996년 스테판 W.Hell은 3광자 들뜸을 주사 형광 현미경에 적용하는 것의 타당성을 검증하기 위해 실험을 설계했고, 이는 3광자 들뜸 형광의 ^[6]개념을 더욱 증명했다.

3광자 현미경은 2광자 들뜸 현미경과 몇 가지 유사점을 가지고 있다.둘 다 포인트스캔 방식을 채용하고 있습니다.둘 다 축방향 및 가로방향에 따라 포커스 렌즈의 위치를 조정하여 3D 샘플을 촬영할 수 있습니다.두 시스템의 구조 모두 핀홀이 없어도 아웃포커스 라이트를 차단할 수 있습니다.그러나 3광자 현미경은 Point 확산 기능, 분해능, 투과 깊이, 초점이 맞지 않는 빛에 대한 저항성, 광표백 강도 등에서 2광자 들뜸 현미경과 다르다.

3광자 들뜸에서 형광체는 3광자를 거의 동시에 흡수한다.들뜸 레이저의 파장은 3회의 광자 현미경 검사에서 약 1200 nm 이상이며, 들뜸 파장의 3분의 1보다 약간 긴 방사 파장이다.3개의 광자 현미경은 긴 들뜸 파장과 높은 차수의 비선형 들뜸으로 인해 조직의 침투가 깊다.단, 3광자 들뜸용 염료의 단면이 상대적으로 작기 때문에 3광자 들뜸용 레이저가 필요하며, 이는 10${\displaystyle {~}^{}{\mathrm{}}^{}}$ 6${\displaystyle {}^{}\text{s}}$/ photon${\displaystyle ){}^{}}$ $({$ 10$^{-82){\text{cm}^6}(s/{\$text${photon}^$2$\}\})$보다 ${\displaystyle {\mathrm{훨씬}}^{}}$ 작다.이온 ${\displaystyle {\mathrm{단면}}^{}}$은 10${\displaystyle ~{\mathrm{}}^{}}$ ${\displaystyle \text{4s}}$ /$$광자 {\$displaystyle$10^{-$49}{\text{$cm$}}^{4}$s/{\$text{cm$^[7]입니다.Ultrashort 펄스는 보통 약 100fs입니다.

결의안

3개의 광자 형광 주사 현미경의 경우, 3차원 강도 점확산 함수(IPSF)는 다음과 같이 나타낼 수 있다.

$=$$3$$I_{2}(\nu,u)\otimes_{3}D$^[8]

${\displaystyle {여기}_{}}$서 $\S {\displaystyle {}_{}}$ 3$({$ _${3})$은 3차원 컨볼루션 연산을 $나타내고$$,$ D({$displaystyle$ D$)$는 일관성이 없는 검출기의 강도 감도를 $나타내고{\displaystyle {}_{}}$, I $1}({$$nu},$ ${\displaystyle {I\mathrm{}}_{}}$ ${\displaystyle 2}$$u},$ u$)$는 $3차원$ 컨볼루션 연산을 나타낸다$.$또는 렌즈(단층 형광체)를 각각 사용한다.3D $IPSF{\displaystyle {}_{}}$ I${\displaystyle {}_{}{1\mathrm{}}_{}}$ ( ${\displaystyle 、u}$ $){$ $displaystyle$ I_${1}$ ( \$nu$ ,$u$ ) }는$$ 다음과 같이 나타낼 수 있습니다.

$displaystyle I_{1$$J_{0}(\nu \rho)\exp(iu/2)\rho$ d$\rho \right$^{$2$^[8]

${\displaystyle {여기}_{}}$서 J 0$(\$은 첫 번째 종류의 순서 0의 베셀 함수입니다.축 및 방사 $좌표{\displaystyle }$ $u{\displaystyle }$$\displaystyle$u 및$$ ${\\displaystyle \nu$는 다음과 같이 정의됩니다$.$

${\displaystyle \mathrm{u}}$ ${\displaystyle =}$ ( 8${\displaystyle \pi }$ / ${\displaystyle {\lambda }_{}}$f ) ${\displaystyle z^{}}$ ${\displaystyle {sin\mathrm{}}^{}}$ 2${\displaystyle {}^{}}$ ${\displaystyle {}_{}}$ （ ${\displaystyle {\alpha \mathrm{}}_{}0\mathrm{}}$ / $2$） { $displaystyle$u$$= ( 8 \$pi$/ \ $syn$_ { $f$) z \ $sin ^$ ${$2} ( \ $alpha _$ { $0 }$/ 2$$) } 、

${\displaystyle \mathrm{\nu }=}$ (${\displaystyle }$2 ${\displaystyle \pi {}_{}}$ /${\displaystyle {}_{}\lambda }$ ${\displaystyle f}$ )r sin${\displaystyle }$⁡ $α$ 0 ( \$displaystyle$ \ $nu =$( 2 \$pi$ / \ $displayda _${ $f$) r \$sin$\ $alpha$_ { $0$^[8]} ,

$여기$서 ${\displaystyle {\alpha \mathrm{}}_{}}$ 0$(\$ _${0})$은 대물렌즈의 숫자 $개구부$이고$$z(\$displaystyle$ z$)$는 실제 디포커스이며$r{\displaystyle }$(\$displaystyle$ r$)$는 방사 좌표입니다.

다른 멀티호톤 기술과의 결합

상관 이미지는 2PEF, 3PEF 및 제3의 고조파 생성(THG)과 같은 다른 멀티포톤 방식을 병렬로 사용하여 얻을 수 있습니다(해당 파장이 다르기 때문에 서로 다른 검출기로 쉽게 분리할 수 있습니다).다음으로 멀티채널 이미지가 구축된다.^[9]

3PEF는 2PEF와도 비교됩니다.방출된 신호가 2PEF보다 ^[9]작더라도 일반적으로 깊이와 함께 Signal-to-Background Ratio(SBR; 신호 대 백그라운드비)의 열화가 작아집니다.

발전

싱과 브래들리에 의해 3광자 들뜸 형광이 관찰되고 Hell에 의해 추가로 검증된 후, Chris Xu는 몇몇 고유 색소체와 생물학적 지표의 들뜸 단면 측정을 보고했고 살아있는 ^[10]세포의 레이저 스캐닝 현미경에 3광자 들뜸 형광을 구현했다.1996년 11월 David Wokosin은 고정 생체 시료 영상촬영을 위해 3개의 광자 들뜸 형광을 적용했다.

2010년대에는 1060 nm 이상의 들뜸 파장을 이용한 심층 조직 이미징을 위해 3개의 광자 현미경을 적용하였다.2013년 1월, Horton, Wang, Kobat는 1700 ^[4]nm의 장파장 창에서 3개의 광자 현미경에 포인트 스캔 방법을 적용하여 온전한 마우스 뇌의 생체 내 딥 이미징을 개발했다.2017년 2월 Dimitre Ouzounov와 Tainyu Wang은 1300nm 파장창에서 ^[11]3광자 현미경을 사용하여 성체 쥐 뇌의 해마에서 GCaMP6 라벨 뉴런의 심층 활성 영상을 시연했다.2017년 5월 Rowlands는 투과 깊이를 높이기 위해 3개의 광자 현미경에 광자 3광자 ^[12]들뜸을 적용했다.2018년 10월 T Wang, D Ouzounov, C Xu는 온전한 마우스 두개골을 통해 ^[13]3개의 광자 현미경을 사용하여 혈관 구조와 GCaMP6 칼슘 활성을 촬영할 수 있었다.

적용들

3광자 현미경은 신경과학,^[14] 종양학 ^[15]등 2광자 들뜸 현미경과 응용 분야가 비슷하다.단, 표준적인 단광자 또는 2광자 들뜸에 비해 3광자 들뜸은 긴 파장을 사용하면 빛의 산란 효과가 감소하고 시료에 ^[16]대한 조명 빔의 투과 깊이가 증가하는 등 여러 가지 이점이 있다.세 개의 광자 현미경법의 비선형 특성은 들뜸 대상을 더 작은 부피로 제한하여 초점 밖의 빛을 줄이고 생물학적 ^[16]샘플의 광 표백을 최소화합니다.이러한 3광자 현미경의 장점은 산란 조직과 신속한 체적 ^[17]이미징 내 깊은 세포 수준에서 생체 내 및 생체 외 조직 형태와 생리를 시각화하는 데 있어 우위를 제공한다.최근 연구에서 Xu는 살아있는 생물학적 시스템의 ^[13]비침습적 연구를 위한 3광자 이미징의 가능성을 입증했습니다.본 논문은 1,320nm의 스펙트럼 들뜸창에서 3광자 형광 현미경을 사용하여 공간 및 시간 분해능이 높은 온전한 두개골(가로 및 축방향 FWHM은 0.96μm, 4.6μm), 큰 FOV(수백 마이크로미터) 및 상당한 깊이(500μm)를 통해 마우스 뇌 구조와 기능을 촬영했다.이 작업은 고밀도 라벨 샘플의 딥 이미징에 대해 이전에 보고된 3PM의 이점 외에 고도로 산란층을 통한 이미징을 위한 고차 비선형 들뜸의 장점을 보여준다.

「 」를 참조해 주세요.

• 이광자 들뜸 현미경법
• 레이저 스캔
• 비선형 광학

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