전체 내부 반사 형광 현미경

Total internal reflection fluorescence microscope

TIRFM(total internal reflection fluorescope, 총내부반사형광현미경)은 일반적으로 200나노미터 미만의 얇은 영역을 관찰할 수 있는 현미경의 일종이다.

TIRFM은 유리 슬라이드에 지지되는 얇은 광학 시료 섹션의 형광 셀 들뜸을 사용하는 이미징 방식입니다.이 기술은 들뜸광이 액체 매체와의 계면에서 투명 고체 커버 글라스에 완전히 내부적으로 반사될 때, 들뜸 [1]빛과 같은 주파수로 고액 계면에서 전자파(EVanesent wave라고도 함)가 발생한다는 원리에 기초하고 있습니다.증발파의 세기는 고체 표면으로부터의 거리에 따라 기하급수적으로 감소하기 때문에 고체에서 수백 나노미터 이내의 형광 분자들만 효율적으로 들뜨게 됩니다.세포 내 소포 또는 구조의 위치에 대한 3차원 정보를 [2]얻을 수 있는 메커니즘도 있지만 형광의 2차원 이미지를 얻을 수 있다.

역사

와이드필드 형광은 1910년에 도입되었습니다.이것은 그림 [3]1과 같이 샘플 전체를 비추는 광학 기술입니다.그 후 1960년에 공초점 현미경법이 도입되어 빛을 핀포인트로 유도하고 빛의 원뿔을 표본으로 조명함으로써 샘플의 배경과 노출 시간을 줄였다.1980년대에 TIRFM의 도입으로 검사 [3]대상 샘플의 얇은 부분만 조명함으로써 배경과 노출 시간이 더욱 단축되었습니다.

배경

TIRFM의 [1]에버넨트파를 생성하는 방법에는 두 가지가 있습니다.첫 번째 방법은 프리즘을 사용하여 레이저를 커버글래스와 미디어/셀 사이의 계면을 향해 입사 각도로 향하게 하여 전체 내부 반사를 발생시키는 프리즘 방법입니다.이 구성은 세포 현미경 검사에 30년 이상 적용되어 왔지만 몇 가지 제한으로 인해 주류 도구가 된 적은 없습니다.프리즘의 구성에는 여러 가지 종류가 있지만 대부분은 시료에 대한 접근을 제한하기 때문에 조작, 시료 공간에 대한 매체 주입, 생리학적 [2]측정이 어렵습니다.또 다른 단점은 역현미경 설계에 기초한 대부분의 구성에서 빛이 시료의 대부분을 통해 증발장 영역의 이미징이 필요한 대물광학과는 반대되는 시료 측에 도입된다는 것이다.이 시스템을 이미지화하는 데는 매우 복잡하고 정밀도가 요구되는데, 이는 프리즘 방법이 많은 생물학자들에 의해 사용되지 않고 오히려 물리학자들에 의해 사용되기만 제한되었다는 것을 의미한다.

다른 방법은 대물렌즈법으로 알려져 있는데, 이는 세포 현미경 검사에서 TIRFM의 사용을 증가시켰으며 시판 용액이 [2]나온 이후 더욱 증가했습니다.이 메커니즘에서는 대상물의 백포커스 평면에서 빔 포커스의 오프축 위치를 변경함으로써 표준 와이드필드 형광과 TIRF를 쉽게 전환할 수 있다.현미경에 부착된 형광 조명기와 관련하여 위치를 변경할 수 있는 액추에이터를 사용하는 등 빔의 위치를 변경하는 몇 가지 개발된 방법이 있습니다.

어플

세포와 분자생물학에서는 세포 접착, 호르몬에 의한 세포 결합, 신경전달물질의 분비, 막역학과 같은 세포 표면에서의 많은 분자 사건들이 기존의 형광 현미경으로 연구되어 왔다.단, 시료표면과 주변배지에 결합되어 있는 불소포자는 평형상태로 존재한다.이러한 분자들이 기존의 형광 현미경으로 들뜨고 검출될 때, 표면에 결합된 형광체로부터의 결과 형광체는 종종 훨씬 더 큰 비결합 분자의 집단 때문에 배경 형광에 의해 압도된다.TIRFM은 표면 결합 형광체를 선택적으로 들뜨게 하는 반면 비결합 분자는 들뜨지 않고 형광체가 발생하지 않습니다.서브미크론 표면 선택성의 사실로 인해 TIRFM은 단일 분자 검출을 위한 선택 방법이 되었습니다.

세포 현미경 검사에는 TIRFM이 많이 사용됩니다.이러한 애플리케이션에는 다음이 포함됩니다.

  • 리간드 결합 및 수용체 이동에 대한 수용체 내구성 동태 측정
  • 형광염료에 의한 세포외이식 소포의 부하를 통한 세포외 현상 관찰
  • 세포외/내구증에서 서로 다른 단백질이 수행하는 역할을 질적, 양적으로 기술한다.
  • 셀과 고체 기판 사이의 접촉 영역으로부터 떨어진 크기, 움직임 및 거리 관찰

개별 소포를 광학적으로 분해하고 그들의 상호작용의 역학을 직접 따라가는 능력으로,[2] TIRFM은 이전에는 불가능했던 방식으로 신경생물학적 과정에 포함된 방대한 수의 단백질을 연구하는 능력을 제공한다.

혜택들

TIRFM은 표준 와이드 필드 및 공초점 형광 현미경 검사에 비해 다음과 같은 몇 가지 이점을 제공합니다.

  • 배경이 상당히 줄어들어 구조를 명확하게 볼 수 있습니다.
  • 흐림 효과를 감소시키는 초점이 맞지 않는 형광이 수집되지 않았습니다.
  • 세포는 현저하게 적은 양의 빛에 노출되어 세포에 대한 광독성을 제한한다.

개요

유리 표면에 닿는 세포를 비추기 위해 총 내부 반사를 사용하는 아이디어는 1956년 [4]E.J. Ambrose에 의해 처음 설명되었습니다.이 아이디어는 1980년대 초 미시간 앤아버 대학의 다니엘[5] 액셀로드에 의해 TIRFM으로 확장되었다.TIRFM은 증발파를 사용하여 유리-수면 바로 옆에 있는 시료의 제한 영역에서 형광체를 선택적으로 조명하고 자극한다.증발하는 전자기장은 계면에서 기하급수적으로 감소하며, 따라서 샘플 매체에 약 100nm 깊이까지만 침투한다.따라서 TIRFM은 세포의 기초 플라즈마막(약 7.5 nm 두께)과 같은 표면 영역을 선택적으로 시각화할 수 있다.단, 시각화된 영역의 폭은 최소 수백 나노미터이므로 TIRF 현미경 검사 시 혈장막 바로 아래의 세포질 영역은 필연적으로 시각화됩니다.혈장막의 선택적 시각화는 높은 축 분해능으로 살아있는 세포에서 혈장막의 특징과 이벤트를 렌더링합니다.

TIRF는 또한 단일 [6][7]분자의 형광을 관찰하는 데 사용될 수 있으며, 이를 생물물리학 및 정량생물학의 중요한 도구로 만든다.TIRF 현미경은 또한 DNA 바이오마커의 단일 분자 검출과 SNP [8]판별에도 적용되어 왔다.

시스 기하학(객관적 TIRFM)과 트랜스 기하학(프리즘 및 도광관 기반 TIRFM)은 전체 내부 반사 효과의 서로 다른 품질을 제공하는 것으로 나타났다.트랜스 지오메트리의 경우 들뜸 광로와 방출 채널이 분리되며, 목적형 TIRFM의 경우 현미경의 목적 및 기타 광학 요소를 공유합니다.프리즘 기반 기하학은 이론적으로 예측된 [9]함수에 가까운 지수적 붕괴를 일으키는 깨끗한 증발파를 생성하는 것으로 나타났다.그러나 목적 기반 TIRFM의 경우, 증발파는 강한 유광으로 오염된다.유광의 세기는 증발파의 10~15%로 나타나 목적형 TIRFM에 의해 얻어진 데이터를 해석하기 어렵다.

메커니즘

(Trans-)내부반사 형광 현미경(TIRFM)도
  1. 객관적으로
  2. 발광빔(신호)
  3. 침지유
  4. 커버 슬립
  5. 샘플
  6. 증발파 범위
  7. 들뜸 빔
  8. 석영 프리즘

TIRFM 장치의 기본 구성 요소는 다음과 같습니다.

  1. 들뜸 빔 광원
  2. 커버슬립&침지오일
  3. 대물 렌즈
  4. 시료
  5. 검출기

목표 기반과 프리즘 기반 TIRFM

목표 기반(cis)과 프리즘 기반(트랜스) TIRFM의 주요 차이점은 프리즘 기반 TIRFM은 에버넨트 필드를 생성하기 위해 프리즘/솔루션 인터페이스를 사용해야 하는 반면, 목표 기반 TIRFM은 프리즘을 필요로 하지 않고 커버 슬립/솔루션 인터페이스를 사용하여 에버넨트 필드를 생성한다는 것입니다.일반적으로 목적 기반의 TIRFM이 더 널리 사용되지만, 순간파 내의 유광 노이즈로 인해 영상 품질이 저하되었습니다.

프리즘 베이스

  • 외부 산란 감소
  • 훨씬 저렴함(수천달러가 아닌 수백달러)
  • 중저범위 확대 및 물몰입 목적에 최적
  • 프리 콜리메이트된 레이저 소스로 가장 간단
  • 넓은 범위의 입사각
    • 최소 현장 깊이를 달성하는 것이 바람직하다.
(Cis-)전내반사형광현미경(TIRFM)도
  1. 샘플
  2. 증발파 범위
  3. 커버 슬립
  4. 침지유
  5. 객관적으로
  6. 발광빔(신호)
  7. 들뜸 빔

목표 기반

  • 고배율 및 조리개
  • 안정적이고 셋업과 정렬이 용이함
  • 프리 콜리메이트된 레이저, 광섬유 또는 기존 아아크 소스와 함께 작동

방법론

TIRFM의 기초 물리학

TIRFM은 Total Internal Reflection의 광학 현상에 기초하고 있습니다.TIRFM에서는 매체 인터페이스에 도달하는 파형이 매체 2로 전송되지 않고 매체 1로 완전히 반사됩니다.전체 내부 반사를 위해서는 매질 2가 매질 1보다 낮은 굴절률을 가져야 하며, 파동은 계면에 충분한 경사각도로 입사해야 한다.전체 내부반사에 수반하는 관측현상은 에버넨트파이며, 이는 계면에서 매질 2로 수직방향으로 뻗어 파장, 굴절률 및 입사각의 계수로서 기하급수적으로 감소한다.시료 표면에서 가까운 불소세포의 들뜸을 증가시키고 용액 내에서 불필요한 불소세포의 들뜸을 감소시키기 위해 사용되는 증발파입니다.

실제 목적 기반 TIRF에서 중간체 1은 일반적으로 고굴절률 유리 커버슬립이고 중간체 2는 낮은 굴절률의 용액 내 샘플입니다.렌즈와 유리 커버 슬립 사이에는 공기를 통한 상당한 굴절을 방지하기 위해 침지 오일이 있을 수 있습니다.

에버넨트 웨이브

흥분성 빛 발생에 대한 임계 각도는 스넬의 법칙에서 도출할 수 있다.

1 n_{의 시료의 굴절률, 22})의 경우 커버 슬립의 굴절률.

따라서 입사각이 c \ _ {에 이르면 전체 내부반사 및 증발파의 효과를 관찰하기 하고 \ displaystyle \ {c를 초과할수록 이러한 효과가 더욱 우세하다.

에버네센트 파동의 세기는 다음과 같이 구한다.

침투 d d

으로 d d µ~100나노미터로 일반적으로 빛의 파장보다 작고 공초점 현미경의 [1][12]슬라이스보다 훨씬 얇습니다.

TIRFM 이미징의 경우 시료 내 여자빔 0 _ 파장을 필터링하여 선택할 수 있습니다.또한 입사각도(\의 범위는 목표의 숫자 개구(NA)에 의해 결정되며 NA > n이어야 합니다.이 파라미터는 여기빔이 대물렌즈로 들어가는 각도를 변경하여 조정할 수 있습니다.마지막으로 용액과 커버슬립의 반사지수( n를 제조사가 실험적으로 찾거나 보고할 수 있다.

들뜸 빔

복잡한 형광 현미경 현미경 기술의 경우 레이저가 매우 균일하고 강렬하며 거의 단색에 가깝기 때문에 선호되는 광원입니다.그러나 ARC LAMP 광원 및 기타 유형의 광원도 작동할 수 있습니다.일반적으로 들뜸빔의 파장은 시료 내 불소체의 요건에 의해 지정되며, 생물학적 시료의 경우 가장 일반적인 들뜸파장은 400~700nm 범위이다.

실제로, 라이트 박스는 고강도 다색 레이저를 생성하며, 이 레이저를 필터링하여 원하는 파장이 샘플을 자극할 수 있도록 합니다.목적 기반 TIRFM의 경우, 여자 빔과 형광 방출 빔이 동일한 목적 렌즈를 통해 포착됩니다.따라서 빔을 분할하기 위해 이색미러를 사용하여 입사한 들뜸빔을 대물렌즈를 향해 반사시켜 방출빔을 검출기 안으로 통과시킨다.방출 파장과 들뜸 파장을 더 분리하기 위해 추가 필터링이 필요할 수 있습니다.

방출 빔

특정 파장의 빛으로 흥분할 때, 불소 염료는 더 긴 파장에서 빛을 다시 방출할 것입니다.TIRFM에서는 인터페이스에 가까운 형광체만 에버넨트필드에 의해 쉽게 들뜨고 100nm이 넘는 형광체는 고도로 감쇠합니다.형광체에 의해 방출되는 빛은 무방향이므로 다양한 강도의 다양한 위치에서 대물 렌즈를 통과합니다.그런 다음 이 신호는 이색 미러를 통과하여 검출기로 이동합니다.

커버슬립&침지유

유리 커버 슬립의 반사율은 일반적으로 n n52인 반면 침지유 굴절률은 n n51에 합니다. 공기 중 매체는 n n의 을 가지므로 들뜸 빔 사이에 굴절이 발생합니다.따라서 오일은 빔이 커버 슬립과 샘플 사이의 경계면에 도달하기 전에 영역을 완충하고 불필요한 계면 상호작용을 방지하는 데 사용됩니다.

대물 렌즈

대물 렌즈 숫자 개구부(NA)는 시스템이 빛을 받아들이거나 방출할 수 있는 각도 범위를 지정합니다.

입사각을 최대로 하려면 , 렌즈의 주변부에 오프 축 각도로 빛을 투과시키는 것이 바람직합니다.

백포커스 플레인(BPF)

백포커스 플레인('어퍼처 플레인'이라고도 함)은 들뜸 빔이 대상을 통과하기 전에 초점을 맞추는 평면입니다.입사 각도가 작거나 더 가파르기 때문에 목표물과 BPF 사이의 거리를 조정하면 다른 영상 배율이 생성될 수 있습니다.빔은 BPF 오프 축을 통과해야 끝의 목표물을 통과하여 각도가 임계 각도보다 충분히 클 수 있습니다.빔은 또한 BPF에 초점을 맞춰야 합니다. 왜냐하면 BPF를 통해 투과되는 빛이 동일한 각도로 커버 슬립과 상호 작용하여 모든 것이 내부에서 [12]반사되기 때문입니다.

샘플

샘플을 유리 커버 슬라이드의 표면에 흡착하고 적절한 형광체로 염색하여 샘플 내에서 원하는 특징을 해결해야 합니다.이것은 다른 형광 현미경 검사 기술과 프로토콜에 부합합니다.

다이크로익(다이크로매틱) 필터

이색 필터는 입사각(일반적으로 45°)에서 사용되는 에지 필터입니다.들뜸 대역에서 빛을 효율적으로 반사하고 방출 [13]대역에서 빛을 전송한다.필터의 45° 각도는 들뜸 빔과 방출 빔의 경로를 구분합니다.필터는 얇은 [14]유리 위에 진공 증착된 여러 층의 금속, 금속 소금 및 유전체로 이루어진 복잡한 시스템으로 구성됩니다.이 코팅은 짧은 파장에 대해서는 높은 반사율을, [15]긴 파장에 대해서는 높은 투과율을 갖도록 설계되었습니다.필터는 선택된 들뜸광(짧은 파장)을 대상물을 통해 시료 평면에 투과시키는 한편, 방호벽 필터에 발광 형광광(긴 파장)을 통과시켜 산란 들뜸광을 레이저 [16]소스 방향으로 반사시킨다.이를 통해 필터를 통과하는 들뜬 방사선과 [17]검출기에 의해 검출된 형광빔이 최대화됩니다.

장벽 필터

장벽 필터는 주로 원치 않는 파장, 특히 짧은 들뜸 빛의 파장을 차단합니다.이 필터는 일반적으로 형광체가 방출하는 파장만을 통과시켜 이 [13]밴드 외부의 불필요한 빛을 모두 차단하는 밴드 패스 필터입니다.보다 현대적인 현미경은 형광체의 특정 방출 [14]파장에 따라 장벽 필터를 변경할 수 있게 합니다.

이미지 검출 및 해상도

이미지는 충전결합디바이스(CCD) 디지털카메라에 의해 인식됩니다.CCD 카메라는 얇은 실리콘 웨이퍼인 광자 검출기를 광감응 영역의 2D 배열로 조립했다.검출기 어레이는 입사광 [2]강도에 따라 변화하는 국소 전하의 형태로 이미지 정보를 캡처하여 저장합니다.도식에 나타나 있듯이 광자는 검출기에 의해 전자로 변환되고 전자는 회로기판에서 [18]판독 가능한 전기신호로 변환된다.그런 다음 전기 신호를 PSF(Point Spread Function)와 함께 변환하여 원래 신호를 샘플링합니다.따라서 이미지 해상도는 디텍터 수에 따라 크게 달라지며 포인트 확산 함수가 이미지 [19]해상도를 결정합니다.

이미지 아티팩트 및 노이즈

대부분의 형광 영상 기술은 샘플의 큰 슬라이스를 (z 방향으로) 조명하고 재구성하기 때문에 배경 노이즈를 나타냅니다.TIRFM은 샘플의 얇은 슬라이스를 형광하기 위해 순간파를 사용하기 때문에 본질적으로 배경 노이즈와 아티팩트가 적습니다.하지만, 포아송 소음, 광학 수차, 광 표백, 그리고 다른 형광 분자와 같은 다른 소음과 인공물들이 여전히 존재한다.

푸아손 소음은 빛의 측정에 있어 근본적인 불확실성이다.이는 형광 [19]광자의 검출 중에 불확실성을 야기할 것이다.특정 측정에서 N개의 광자를 측정하면, 실제 평균 값이

는 N + µN ~N - µN [20]의 범위내입니다.이 소음으로 인해 잘못된 픽셀 위치에 객체가 잘못 표시될 수 있습니다.

광학 이상은 형광광이나 현미경의 회절과 객관적 정렬 불량에 의해 발생할 수 있습니다.샘플 슬라이드상의 빛의 회절은 형광 신호를 확산시켜, 복잡한 화상에 흐릿한 결과를 가져올 수 있습니다.마찬가지로 대물 렌즈, 필터 및 검출기 사이에 정렬이 어긋나면 들뜸 또는 방출 빔이 초점이 맞지 않아 영상이 [15]흐릿해질 수 있습니다.

광표백은 형광체 내의 공유결합 또는 비공유결합이 들뜸광에 의해 파괴되어 더 이상 형광을 [21]발생시킬 수 없을 때 발생할 수 있다.형광 물질은 항상 들뜬 방사선의 에너지에 의해 어느 정도 저하되며 형광이 희미해져 어두운 흐릿한 이미지를 [22]생성하게 됩니다.광표백은 불가피하지만 불필요한 광노출을 피하고 광산란을 [14]최소화하기 위해 침지유를 사용하면 최소화할 수 있습니다.

자기 형광은 구조 내의 천연 화합물이 상대적으로 짧은 파장에서 들뜬 후 형광을 발생시키는 특정 세포 구조에서 발생할 수 있습니다(여진 [19]파장과 유사).유도 형광은 또한 특정 비자율 형광 화합물이 특정 화학 물질([14]포름알데히드 등)에 결합한 후 형광이 될 때 발생할 수 있다.이러한 형광으로 인해 영상에서 왜곡 또는 배경 노이즈가 발생할 수 있습니다.다른 형광 화합물로부터의 노이즈는 필터를 사용하여 원하는 형광 파장을 포착하거나 시료에 자가 형광 화합물이 존재하지 않도록 함으로써 효과적으로 제거할 수 있다.

현재 및 미래 작업

현대의 형광 기술은 약간의 흐림이나 소음을 제거하는 방법을 통합하려고 시도합니다.광학 수차는 일반적으로 결정론적입니다(영상 프로세스 전체 및 여러 샘플 [19]간에 일정함).결정론적 흔들림은 신호를 디콘볼루션하고 알려진 아티팩트를 감산함으로써 제거할 수 있습니다.디콘볼루션 기술은 원래 형광 신호를 얻고 아티팩트를 [20]제거하기 위해 역 푸리에 변환을 사용하는 것입니다.

그럼에도 불구하고 디콘볼루션(deconvolution)은 강한 형광 신호가 있거나 소음이 명확하게 식별될 때만 작동하는 것으로 나타났다.또한 디콘볼루션(deconvolution)은 통계 정보를 포함하지 않고 포이손 소음과 같은 비결정론적 소음을 줄일 수 없기 때문에 성능이 떨어진다.더 나은 영상 해상도와 품질을 얻기 위해 연구자들은 통계 기법을 사용하여 [19][23]검출기에서 광자가 분포할 수 있는 확률을 모델링했다.최대우도법이라고 불리는 이 기술은 성능 [23]속도를 향상시키기 위해 알고리즘에 의해 더욱 개선되고 있습니다.

레퍼런스

  1. ^ a b c Fish, Kenneth N. (October 2009). "Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy". Current Protocols in Cytometry. 0 12: Unit12.18. doi:10.1002/0471142956.cy1218s50. ISSN 1934-9297. PMC 4540339. PMID 19816922.
  2. ^ a b c d e "Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy". Nikon’s MicroscopyU. Retrieved 2021-12-06.
  3. ^ a b "What Is Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy & Is It Right For You?". Cheeky Scientist. 2021-03-11. Retrieved 2021-12-06.
  4. ^ Ambrose, EJ (24 Nov 1956). "A surface contact microscope for the study of cell movements". Nature. 178 (4543): 1194. Bibcode:1956Natur.178.1194A. doi:10.1038/1781194a0. PMID 13387666. S2CID 4290898.
  5. ^ Axelrod, D. (1 April 1981). "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence". The Journal of Cell Biology. 89 (1): 141–145. doi:10.1083/jcb.89.1.141. PMC 2111781. PMID 7014571.
  6. ^ Yanagida, Toshio; Sako, Yasushi; Minoghchi, Shigeru (10 February 2000). "Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells". Nature Cell Biology. 2 (3): 168–172. doi:10.1038/35004044. PMID 10707088. S2CID 25515586.
  7. ^ 안드레 등교차 상관 tirf/afm은 자체 조립된 합성 미오신 필라멘트를 따라 강제 발생 헤드의 비대칭 분포를 나타냅니다.Biophysical Journal, 96:1952~1960, 2009.
  8. ^ Sapkota, K.; et al. (2019). "Single-Step FRET-Based Detection of Femtomoles DNA". Sensors. 19 (16): 3495. Bibcode:2019Senso..19.3495S. doi:10.3390/s19163495. PMC 6719117. PMID 31405068.
  9. ^ Ambrose, W; et al. (1999). "Single-molecule detection with total internal reflection excitation: comparing signal-to-background and total signals in different geometries". Cytometry. 36 (3): 224–31. doi:10.1002/(sici)1097-0320(19990701)36:3<224::aid-cyto12>3.0.co;2-j. PMID 10404972.
  10. ^ Mattheyses A. and Axelrod, D. (2006). "Direct measurement of the evanescent field profile produced by objective-based TIRF". J Biomed Opt. 11 (1): 014006A. doi:10.1117/1.2161018. PMID 16526883. S2CID 27507504.
  11. ^ Brunstein M, Teremetz M, Hérault K, Tourain C, Oheim, M. (2014). "Eliminating unwanted far-field excitation in objective-type TIRF. Part I." Biophys. J. 106 (5): 1020–1032. Bibcode:2014BpJ...106.1020B. doi:10.1016/j.bpj.2013.12.049. PMC 4026778. PMID 24606927.{{cite journal}}: CS1 maint: 여러 이름: 작성자 목록(링크)
  12. ^ a b Microscopy: Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy (Daniel Axelrod), retrieved 2021-12-06
  13. ^ a b "Introduction to Fluorescence Filters - Semrock". www.semrock.com. Retrieved 2021-12-06.
  14. ^ a b c d "Contrast Techniques in Light Microscopy". Routledge & CRC Press. Retrieved 2021-12-06.
  15. ^ a b "Specialized Microscopy Techniques - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Olympus LS". www.olympus-lifescience.com. Retrieved 2021-12-06.
  16. ^ "Fluorescence Microscopy - Fluorescence Filters Olympus LS". www.olympus-lifescience.com. Retrieved 2021-12-06.
  17. ^ Mueller, Michiel (2005-12-07). Introduction to Confocal Fluorescence Microscopy, Second Edition. doi:10.1117/3.639736. ISBN 9780819481177.
  18. ^ K.K, Hamamatsu Photonics. "A visual guide to CCD vs. EM-CCD vs. CMOS". camera.hamamatsu.com. Retrieved 2021-12-06.
  19. ^ a b c d e Mondal, Partha Pratim; Diaspro, Alberto (2014), Mondal, Partha Pratim; Diaspro, Alberto (eds.), "Image Reconstruction for Fluorescence Microscopy", Fundamentals of Fluorescence Microscopy: Exploring Life with Light, Dordrecht: Springer Netherlands, pp. 189–202, doi:10.1007/978-94-007-7545-9_10, ISBN 978-94-007-7545-9, retrieved 2021-12-06
  20. ^ a b Mueller, Michiel (2005-12-07). Introduction to Confocal Fluorescence Microscopy, Second Edition. doi:10.1117/3.639736. ISBN 9780819481177.
  21. ^ O’Mara, P.; Farrell, A.; Bones, J.; Twomey, K. (2018-01-01). "Staying alive! Sensors used for monitoring cell health in bioreactors". Talanta. 176: 130–139. doi:10.1016/j.talanta.2017.07.088. ISSN 0039-9140. PMID 28917732.
  22. ^ "Fluorophore Photobleaching Literature References". Nikon’s MicroscopyU. Retrieved 2021-12-06.
  23. ^ a b Varma, Mahesh Ravi; Rajan, K.; Mondal, Partha Pratim (2012-09-01). "Fast image reconstruction for fluorescence microscopy". AIP Advances. 2 (3): 032174. Bibcode:2012AIPA....2c2174V. doi:10.1063/1.4754604.

외부 링크