변환(유전자)

Transformation (genetics)
암 진행 과정에서 발생하는 악성 변형이라는 관련 없는 과정과 혼동해서는 안 된다.
이 화상은 세균세포1로부터의 유전자를 세균세포2로 이동시킨다.박테리아 세포 2가 새로운 유전 물질을 흡수하는 이 과정을 변형이라고 합니다.

분자생물학과 유전학에서 변형은 세포막을 통해 주변으로부터 외부 유전 물질을 직접 흡수하고 결합함으로써 생기는 세포의 유전적 변화이다.형질이 변하기 위해서는 수용세균이 능력 상태에 있어야 하며, 이는 자연에서 기아와 세포 밀도 같은 환경 조건에 대한 시간 제한적 반응으로 발생할 수 있으며,[1] 실험실에서도 유발될 수 있다.

형질전환은 외인성 유전물질이 한 박테리아에서 다른 박테리아로 전달되는 세 가지 과정 중 하나이며, 나머지 두 가지는 접합(직접 접촉하는 두 박테리아 세포 사이의 유전물질 전달)과 변환(박테리오파지 바이러스에 의한 외부 DNA의 숙주 박테 주입)이다.형질전환에서 [1]유전물질은 매개체를 통과하며, 흡수는 수용세균에 [1]전적으로 의존한다.

2014년 현재 약 80종의 박테리아가 그램 양성 박테리아와 그램 음성 박테리아로 균등하게 나뉘어 변형이 가능한 것으로 알려져 있다. 보고서 중 몇 개가 단일 [1]논문에 의해 뒷받침되기 때문에 그 수는 과대 추정될 수 있다.

"변환"은 또한 동물과 식물 세포를 포함한 비박테리아 세포에 새로운 유전 물질을 삽입하는 것을 묘사하기 위해 사용될 수 있다; 그러나 "변환"은 동물 세포와 관련하여 특별한 의미를 가지며, 암 상태로의 진행을 나타내기 때문에, 그 과정은 보통 "변환"[2]이라고 불린다.

역사

박테리아의 변형은 1928년 영국의 세균학자 프레드릭 그리피스에 [3]의해 처음 증명되었다.그리피스는 쥐에게 폐렴 백신을 접종하기 위해 열을 가한 박테리아의 주사가 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 데 관심이 있었다.그러나 그는 비독성 폐렴구균 변종인 스트렙토코쿠스가 열로 죽은 치명적인 변종에 노출된 후 치명적으로 변할 수 있다는 것을 발견했다.그리피스는 가열된 변종에서 나온 어떤 "변형 원리"가 이 무해한 변종을 병들게 만드는 원인이라는 가설을 세웠다.1944년에 이 "변형 원리"는 오스왈드 에이버리, 콜린 맥레오드, 맥클린 맥카티에 의해 유전적인 것으로 확인되었다.그들은 치명적인 변종인 폐렴으로부터 DNA를 분리했고, 이 DNA만을 사용하여 무해한 변종을 치명적인 변종으로 만들 수 있었다.그들은 박테리아에 의한 DNA의 흡수 및 통합을 "변환"이라고 불렀다(Avery-MacLeod-Mcarty [4]실험 참조).애버리 외 연구진의 실험 결과는 처음에는 과학계에서 회의적으로 받아들여졌고 유전자 표지의 개발과 조슈아 레더버그에 의한 유전자 전달의 다른 방법(1947년 결합과 1953년 변환)이 발견되고 나서야 애버리의 실험이 [5]받아들여졌다.

원래 일반적으로 사용되는 실험실 생물인 대장균은 변형에 내성이 있다고 생각되었다.그러나 1970년 Morton Mandel과 Akiko Higa는 대장균이 염화칼슘 [6]용액으로 치료한 후 도우미 파지를 사용하지 않고 박테리오파지의 DNA를 흡수하도록 유도될 수 있음을 보여주었다.2년 뒤인 1972년 스탠리 노먼 코헨, 애니 창, 레슬리 허는 CaCl
2 치료가 플라스미드 [7]DNA 변형에도 효과적이라는 것을 보여주었다.만델과 히가의 변형 방법은 나중에 더글라스 하나한에 [8]의해 개선되었다.대장균에서 인위적으로 유도된 역량의 발견은 박테리아를 변형시키는 효율적이고 편리한 방법을 만들어냈으며, 이는 생명공학과 연구에서 더 간단한 분자 복제 방법을 가능하게 했고, 현재는 일상적으로 사용되는 실험실 절차이다.

1980년대 후반에 전기 변형을 이용한 변형이 개발되어 체외 변형의 효율을 높이고 변형이 가능한 [9]세균 균주의 수를 증가시켰다.1982년 [10]생쥐 배아에 생쥐 성장호르몬 유전자를 주입해 유전자 변형 쥐가 탄생하는 등 동식물 세포의 변형도 연구됐다.1897년 식물 종양을 일으킨 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스가 발견됐고 1970년대 초 종양유도제는 Ti 플라스미드라고 불리는 DNA 플라스미드로 [11]밝혀졌다.종양을 일으킨 플라스미드의 유전자를 제거하고 새로운 유전자를 추가함으로써, 연구원들은 식물에 A. tumefaciens를 감염시키고 박테리아가 선택한 DNA를 식물의 [12]게놈에 삽입하도록 할 수 있었다.모든 식물 세포가 A. tumefaciens에 의해 감염되기 쉬운 것은 아니기 때문에, 전기 주입과 [13]미세 주입을 포함한 다른 방법들이 개발되었습니다.입자 폭격은 1980년대 [14][15][16]존 샌포드에 의해 바이오리스틱 입자 전달 시스템(제네건)의 발명으로 가능해졌다.

정의들

형질전환은 박테리아 사이에서 자연에서 일어나는 세 가지 형태의 수평 유전자 이동 중 하나로, 특성을 코드하는 DNA가 한 박테리아에서 다른 박테리아로 전달되고 상동 재조합에 의해 수용체 게놈에 통합된다; 다른 두 가지는 박테리오파지에 의해 수행되고, 그리고 유전자가 유전자의 결합이다.e는 박테리아 [1]간의 직접 접촉을 통해 전달됩니다.형질전환에서 유전물질은 중간배지를 통과하고 흡수는 전적으로 [1]수용세균에 의존한다.

능력이란 환경으로부터 외인성 DNA를 흡수할 수 있는 일시적인 상태를 말합니다.[1] 실험실에서 유도될 수 있습니다.

이것은 공통의 원핵생물 조상으로부터 물려받은 고대 과정으로 DNA 손상, 특히 스트레스를 받는 조건에서 얻은 손상의 재조합 복구를 촉진하는 데 유익한 적응이다.자연적 유전자 변형은 [1][17]유전자 다양성을 생성하는 DNA 손상을 복구하기 위한 적응으로 보인다.

헬리코박터균, 레지오넬라 폐렴필라, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoae,[18] Hamophilus influence 및 Vibrio cholerae와 같은 의학적으로 중요한 그램 음성 박테리아 종에서 변형이 연구되었다.그것은 또한 Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter bayly와 같은 토양에서 발견되는 그램 음성 종과 랄스토니아 솔라나카룸, 자일라 파스티디오사 [18]같은 그램 음성 식물 병원체에서도 연구되었다.그램 양성균의 형성은 스트렙토코커스 폐렴구균, 스트렙토코커스 뮤탄스, 황색포도상구균, 스트렙토코커스 샹구니와 같은 의학적으로 중요한 종과 그램 양성 토양 세균인 바실러스 서브틸리스에서 [17]연구되어 왔다.또한 여러 [19]다른 등급으로 분포하는 최소 30종의 슈도모나도타에서 보고되었다.변형과 관련하여 가장 잘 연구된 의사모나도타는 의학적으로 중요한 인간 병원균 Neisseria gonorhoae, Hemophilus influence 및 헬리코박터균이다.[17]

"변환"은 또한 동물과 식물 세포를 포함한 비박테리아 세포에 새로운 유전 물질을 삽입하는 것을 묘사하기 위해 사용될 수 있다; 그러나 "변환"은 동물 세포와 관련하여 특별한 의미를 가지며, 암 상태로의 진행을 나타내기 때문에, 그 과정은 보통 "변환"[2]이라고 불린다.

타고난 역량과 혁신

주요 기사: 타고난 능력

2014년 현재 약 80종의 박테리아가 그램 양성 박테리아와 그램 음성 박테리아로 균등하게 나뉘어 변형이 가능한 것으로 알려져 있다. 보고서 중 몇 개가 단일 [1]논문에 의해 뒷받침되기 때문에 그 수는 과대 추정될 수 있다.

선천적으로 유능한 박테리아는 세포막을 가로질러 DNA를 가져오는 단백질 기계를 제공하는 유전자 세트를 운반합니다.세포로의 외인성 DNA의 운반은 세포질막에서의 [20]DNA 전이효소 복합체뿐만 아니라 타입 IV 필리와 타입 II 분비 시스템의 조립에 관여하는 단백질을 필요로 할 수 있다.

그램 양성 박테리아와 그램 음성 박테리아 사이의 세포 외피 구조의 차이로 인해, 이들 세포에서 DNA 흡수의 메커니즘에 약간의 차이가 있지만, 그들 대부분은 관련된 단백질을 포함하는 공통적인 특징을 공유한다.DNA는 먼저 DNA 수용체에 있는 유능한 세포의 표면에 결합하고, DNA 전달 효소를 [21]통해 세포질막을 통과합니다.단가닥 DNA만 통과할 수 있고, 다른 가닥은 그 과정에서 핵산 분해 효소에 의해 분해됩니다.전위된 단일 가닥 DNA는 RecA의존성 과정을 통해 세균 염색체에 통합될 수 있다.그램 음성 세포에서, 여분의 막의 존재로 인해, DNA는 외막의 세크리틴에 의해 형성된 채널의 존재를 필요로 한다.필린은 능력을 위해 필요할 수 있지만,[22] 그 역할은 불확실합니다.DNA의 흡수는 특정 DNA 흡수가 효율적인 DNA [23]흡수를 촉진할 수 있지만, 일반적으로 비배열 특이적이다.

자연 변환

자연적 변환은 DNA 이식을 위한 박테리아 적응으로, 이 [20][19]과정에 책임이 있는 것으로 보이는 수많은 박테리아 유전자의 발현에 의존합니다.일반적으로 변환은 복잡하고 에너지가 필요한 개발 프로세스입니다.박테리아가 외인성 DNA를 염색체에 결합, 흡수, 재조합하기 위해서는 유능해야 한다. 즉, 특별한 생리적 상태에 들어가야 한다.서브틸리스균의 능력발달을 위해서는 약 40개의 [24]유전자가 발현되어야 한다.숙주 염색체에 통합된 DNA는 보통 (희귀한 예외는 있지만) 같은 종의 다른 박테리아로부터 파생되며, 따라서 상주 염색체와 상동한다.

B. 서브틸리스에서 전달된 DNA의 길이는 1271kb(100만 [25]염기 이상)보다 크다.전달된 길이는 이중 가닥 DNA일 가능성이 높으며, 종종 전체 염색체 길이 4215kb의 1/[26]3 이상이다.수용 세포의 약 7-9%가 염색체 [27]전체를 차지하는 것으로 보인다.

자연변형의 능력은 많은 원핵생물에서 발생하는 것으로 보이며, 지금까지 67종의 원핵생물종이 이 과정을 [19]거치는 것으로 알려져 있다.

형질전환 능력은 일반적으로 높은 세포 밀도 및/또는 영양 제한에 의해 유발되며, 이는 세균 증식의 정지 단계와 관련된 조건이다.Hemophilus influence의 변형은 세균의 성장이 정지기에 [28]가까워짐에 따라 기하급수적인 성장이 끝날 때 가장 효율적으로 일어난다.다른 많은 연쇄상구균과 마찬가지로 연쇄상구균의 변형은 높은 세포 밀도로 일어나며 생물막 [29]형성과 관련이 있다.B. 서브틸리스의 능력은 특히 아미노산 [30]제한 조건 하에서 로그 성장이 끝날 때 유도된다.마찬가지로, Micrococcus luteus(연구되지 않은 방선균류의 대표)에서는, 역량이 지수 성장 중기 중기에 발달하고 아미노산 결핍에 [31][32]의해서도 유발된다.

온전한 숙주와 플라스미드 DNA를 방출함으로써, 특정 박테리오파지는 [33]변형에 기여하는 것으로 생각된다.

DNA 수복에 대한 적응으로 변형

역량은 특히 DNA 손상 조건에 의해 유도된다.예를 들어 DNA 손상제인 미토마이신C(DNA 가교제)와 플루오로퀴놀론(이중사슬 절단을 [34]일으키는 토포이소머라아제 억제제)에 의해 폐렴 스트렙토코쿠스에서 변형이 유도된다.B. 서브틸리스에서는 DNA 손상제인 [35]자외선에 의해 형질이 증가한다.헬리코박터균에서는 DNA 자이라아제와 상호작용하여 이중 가닥 절단을 초래하는 시프로플록사신이 역량 유전자의 발현을 유도하고, 이에 따라 레지오넬라 기모필라를 사용하여 변환 빈도를[36] 높임으로써 64개의 독성 분자를 시험하여 역량을 유도하였다.[37]이들 중 6개만이 강한 유도를 유발한 DNA 손상 물질이다.이러한 DNA 손상 물질로는 미토마이신 C(DNA 가닥 간 교합을 일으키는), 노르플록사신, 오브록사신 및 날리딕산(DNA 자이라아제의 억제제), 비클로마이신(단일 가닥 및 이중 가닥[38][39] 절단을 일으키는), 히드록시우레아(DNA 염기[40] 산화를 유도) 등이 있었다.자외선은 또한 L. pneumophila의 능력을 유발했다.Charpentier et al.[37]는 변형 능력이 아마도 DNA 손상 반응으로 진화했을 것이라고 제안했다.

대수적으로 성장하는 박테리아는 세포 내에 존재하는 게놈 복제의 수에 관해 정상 박테리아와 다르며, 이것은 중요한 DNA 복구 과정을 수행하는 능력에 영향을 미친다.로그 성장 중에는 세포 분열이 염색체 복제와 정확하게 일치하지 않기 때문에 염색체의 특정 영역의 두 개 이상의 복사가 세균 세포에 존재할 수 있다.상동 재조합 수리(HRR) 프로세스는 이중 가닥 파손과 같은 이중 가닥 손상을 수리하는 데 특히 효과적인 핵심 DNA 수리 프로세스입니다.이 과정은 손상된 염색체 외에 두 번째 상동 염색체에 의존한다.로그 성장 동안, 한 염색체의 DNA 손상은 다른 상동 염색체의 배열 정보를 사용하여 HRR에 의해 복구될 수 있다.그러나 세포가 정지기에 가까워지면 일반적으로 염색체의 복사본이 하나뿐이며,[41] HRR은 변환에 의해 세포 외부에서 상동 템플릿의 입력을 필요로 한다.

변형 적응 기능이 DNA 손상 복구인지 여부를 테스트하기 위해 자외선에 의해 조사된 B. 서브틸리스를 손상 물질로 사용하여 일련의 실험을 수행하였다(Michod [42]등 및 Bernstein 등에 의해 검토됨).[41]이러한 실험의 결과는 DNA를 변형시키는 것이 수용체 DNA의 자외선에 의해 유입된 잠재적으로 치명적인 DNA 손상을 복구하는 역할을 한다는 것을 보여주었다.수리를 담당하는 특정 프로세스는 HRR이었을 가능성이 높습니다.박테리아에서의 변형은 원시적인 성적 과정으로 볼 수 있는데, 그 이유는 박테리아가 다음 세대에 전해지는 재조합 DNA를 형성하기 위해 두 사람의 상동 DNA의 상호작용을 포함하기 때문이다.원핵생물에서 세균의 변형이 진핵생물에서 감수생식 성생식을 일으킨 조상 과정이었을 수도 있다.

실험실에서의 변환 방법 및 메커니즘

세균 변형의 개략도– 먼저 인위적인 능력을 유도해야 한다.

세균

인위적인 능력은 DNA에 수동적으로 침투하는 세포를 [43]자연에서 일반적으로 발생하지 않는 조건에 노출시킴으로써 DNA에 수동적으로 침투시키는 것을 포함하는 실험실 절차에서 유도될 수 있다.일반적으로 세포는 열 펄스(히트 쇼크)에 노출되기 전에 차가운 조건에서 2가의 양이온(종종 염화칼슘)을 포함한 용액에 배양됩니다.염화칼슘은 세포막을 부분적으로 파괴하여 재조합 DNA가 숙주 세포로 들어갈 수 있게 한다.DNA를 차지할 수 있는 세포는 능력 있는 세포라고 불린다.

20 mM Mg에서 그램 음성세균이 성장하면 이온결합과 공유결합의 비율이 증가하여 단백질-리포다당결합의 수가 감소하여 막의 유동성이 증가하여 [44]변형이 촉진되는 것으로 확인되었다.여기서 리포다당류의 역할은 아마도 향상된 DNA 접근성 때문에 짧은 O-사이드 사슬이 더 효과적으로 변형된다는 관찰로부터 검증된다.

대장균 등 세균의 표면은 세포 표면의 인지질과 리포다당류에 의해 음전하를 띠며 DNA도 음전하를 띠게 된다.따라서 2가 양이온의 한 가지 기능은 인산염기와 다른 음전하를 조정하여 전하를 차폐하여 DNA 분자가 세포 표면에 부착되도록 하는 것입니다.

대장균 세포로의 DNA 진입은 접착 구역 또는 바이엘 접합으로 알려진 채널을 통해 이루어지며, 전형적인 세포는 400개의 그러한 구역을 가지고 있다.그들의 역할은 경쟁적으로 DNA 흡수를 억제하는 코발라민이 발견되었을 때 확립되었다.DNA 흡수에 관여하는 다른 유형의 채널은 폴리(HB):폴리 P:Ca로 구성됩니다.이 폴리(HB)는 DNA를 감싸는 것으로 생각되며(그 자체가 폴리인산), Ca [44]이온에 의해 형성된 차폐로 운반된다.

차가운 상태에서 세포가 2가 양이온에 노출되면 세포 표면 구조가 변화하거나 약해져 DNA에 더 잘 투과되도록 할 수 있다.열 펄스는 세포막을 가로질러 열 불균형을 만들어 DNA가 세포 구멍이나 손상된 세포벽을 통해 세포 안으로 들어가게 하는 것으로 생각됩니다.

일렉트로포레이션은 능력을 높이는 또 다른 방법이다.이 방법에서 세포는 10-20 kV/cm의 전장으로 잠시 충격을 받고, 이는 플라스미드 DNA가 들어갈 수 있는 세포막에 구멍을 만드는 것으로 생각된다.감전 후, 구멍은 세포의 막 복구 메커니즘에 의해 빠르게 닫힙니다.

효모균

사카로미세스 세레비시아이를 포함한 대부분의 효모는 환경에서 외인성 DNA에 의해 변형될 수 있다.연구실에서는 [45]이러한 변환을 고주파수로 용이하게 하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다.

  • 효모세포는 효소로 처리되어 세포벽을 분해하여 구상세포를 생성할 수 있다.이 세포들은 매우 연약하지만 외래 DNA를 빠른 [46]속도로 흡수한다.
  • 온전한 효모세포를 세슘이나 리튬과 같은 알칼리 양이온에 노출시키는 것은 세포가 플라스미드 [47]DNA를 차지할 수 있게 한다. 이후 프로토콜은 아세트산 리튬, 폴리에틸렌 글리콜, 단일 가닥 [48]DNA를 사용하여 이 변환 방법을 채택했다.이러한 프로토콜에서, 단일 가닥 DNA는 효모 세포벽에 우선적으로 결합되어 플라스미드 DNA가 그렇게 하는 것을 방지하고 [49]변형에 사용할 수 있도록 한다.
  • 일렉트로포레이션:전기 충격을 사용하여 세포막에 일시적인 구멍을 형성합니다. 이렇게 하면 위에서 설명한 [50]바와 같이 박테리아에 대해 DNA가 들어갈 수 있습니다.
  • 효모세포를 변형시키기 위해 효소적 소화[51] 또는 유리구슬에[52] 의한 교반도 사용할 수 있다.

효율성 – 효모속과 종류에 따라 다른 [53]효율로 외래 DNA를 흡수합니다.또한, 대부분의 변형 프로토콜은 제빵사의 효모인 S. cerevisiae에 대해 개발되었기 때문에 다른 종에는 적합하지 않을 수 있습니다.한 종 내에서도 다른 변종들은 다른 변환 효율을 가지며 때로는 세 가지 크기만큼 차이가 나기도 합니다.예를 들어, S. cerevisiae 균주를 플라스미드 YEP13 10 ug로 변형시켰을 때, DKD-5D-H 균주는 550~315개의 집락을 산출한 반면, OS1 균주는 5개보다 적은 [54]집락을 산출했다.

식물

식물 세포에 DNA를 이식하는 방법은 여러 가지가 있다.벡터 매개 메서드에는 다음과 같은 것이 있습니다.

  • 아그로박테륨 매개 변환은 가장 쉽고 간단한 식물 변환이다.식물 조직(종종 잎)은 10x10mm와 같이 작은 조각으로 잘라서 아그로박테륨을 함유한 액체에 10분간 담근다.그 박테리아는 상처에 의해 노출된 많은 식물 세포에 부착될 것이다.식물 세포는 상처와 관련된 페놀 화합물을 분비하여 아그로박테륨의 독성 오퍼론을 상향 조절합니다.독성 오퍼론은 세균 단백질과 DNA로부터 (보더 배열이라고 불리는 특정한 인식 모티브로 표현되고, 독성이 있는 플라스미드에서 하나의 가닥으로 제거되는) 식물 세포에서 필라스라고 불리는 구조를 통해 식물 세포로 수출되는 타입 IV 분비 시스템의 일부인 단백질을 암호화하는 많은 유전자를 포함합니다.전달된 DNA(T-DNA라고 함)는 오른쪽 경계(RB)의 T-DNA 끝에 공유 결합되어 있는 아그로박테륨 단백질 VirD2에 존재하는 핵 국재 신호에 의해 식물 세포핵으로 시험된다.정확히 어떻게 T-DNA가 숙주 식물 게놈 DNA에 통합되는지는 식물 생물학 연구의 활발한 영역이다.T-DNA에 선택 마커(예: 항생제 내성 유전자)가 포함되어 있다고 가정하면, 변형된 식물 조직은 새싹을 생성하기 위해 선택적 배지에서 배양될 수 있다.새싹은 뿌리 형성을 촉진하기 위해 다른 배지로 옮겨진다.일단 뿌리가 유전자 변형 싹에서 자라기 시작하면, 식물은 정상적인 라이프 사이클을 완성하기 위해 흙으로 옮겨질 수 있습니다.이 첫 번째 식물의 씨앗은 선택적인 (항생제를 포함한) 위에 심을 수 있고, 만약 제초제 내성 유전자를 사용한다면, 대체적으로 토양에 심을 수 있고, 나중에 야생형 분리제를 죽이기 위해 제초제로 처리될 수 있습니다.아라비도시스 탈리아나와 같은 몇몇 식물 종들은 꽃이나 식물 전체를 담그면 전형적으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 현탁액으로 변형될 수 있다(C=Tumefaciens, 58=Twaniens, Newhaca에 있는 코넬 대학의 과수원에 있는 벚나무에서 A. 투메파시엔스의 이 특별한 변종이 분리된 해).많은 식물들이 이 방법에 의한 변환에 대해 여전히 거부감을 갖고 있지만, 이러한 방식으로 성공적으로 수정된 종을 목록에 계속 추가하는 연구가 진행 중이다.
  • 바이러스 변환(전달):원하는 유전자 물질을 적절한 식물 바이러스로 포장하고 이 변형 바이러스가 식물에 감염되도록 합니다.유전물질이 DNA라면 염색체와 재결합해 변형세포를 만들 수 있다.하지만, 대부분의 식물 바이러스의 게놈은 감염된 세포의 세포질에서 복제되는 단일 가닥 RNA로 구성됩니다.이러한 게놈에서 이 방법은 트랜스펙션의 한 형태이며 실제 변환이 아닙니다. 삽입된 유전자가 세포의 핵에 도달하지 않고 숙주 게놈에 통합되지 않기 때문입니다.감염된 식물의 자손은 바이러스가 없고 삽입된 유전자도 없다.

벡터리스 방식에는 다음과 같은 것이 있습니다.

  • 진건:입자 충격, 마이크로 분사 충격 또는 생물학이라고도 합니다.금이나 텅스텐 입자는 DNA로 코팅된 후 어린 식물 세포나 식물 배아로 발사된다.어떤 유전 물질은 세포에 남아서 그것들을 변형시킬 것이다.이 방법을 사용하면 식물 플라스티드의 변환도 가능합니다.변환 효율은 아그로박테륨 매개 변환보다 낮지만, 대부분의 식물은 이 방법으로 변환될 수 있다.
  • 일렉트로포레이션:높은 전계 강도의 전기 펄스를 사용하여 세포막에 일시적인 구멍을 형성합니다. 이를 통해 위에서 설명한 [55]바와 같이 박테리아에 대해 DNA가 들어갈 수 있습니다.

곰팡이

트랜스제닉 곰팡이를 만드는 방법에는 식물에 사용되는 것과 유사한 것이 있다.그러나 균류는 현미경적 특성과 생화학적 특성으로 인해 다르게 취급되어야 한다.

  • 주요 이슈는 일부 균류의 일부가 있는 원핵이다; 원핵 세포는 각각의 부모 균 중 하나인 두 개의 반수체 핵을 포함한다.이들 중 하나만 변형되면, 원칙적으로, 변형된 핵의 비율은 각 포자 [56]형성 후에 감소합니다.
  • 곰팡이 세포벽은 DNA 흡수를 방해하기 때문에 종종 (부분적인) 제거가 필요하다;[57] 때로는 필요한 [56]완전한 분해는 원형질체를 생성한다.
  • 균사균은 필라멘트 균사로 구성되어 있는데, 균사균은 내부 세포벽에 의해 분리되어 영양소와 세포소기관, 심지어 핵이 각각의 균사를 통과할 수 있도록 충분히 큰 기공에 의해 방해를 받습니다.그 결과, 일반적으로 개별 세포는 분리될 수 없습니다.인접한 변환 세포는 항생제 [56]내성을 위한 영양소나 단백질을 전달함으로써 선택 치료에 면역이 되는 변환되지 않은 세포를 만들 수 있기 때문에 문제가 있다.
  • 게다가, 이러한 균류의 성장(그리고 그로 인해 유사 분열)은 균사체 끝에서만 일어나며,[56] 이것은 또한 문제를 일으킬 수 있습니다.

앞에서 설명한 바와 같이, 식물의 형질전환에 사용되는 일련의 방법들은 곰팡이에서도 효과가 있습니다.

  • 아그로박테륨은 식물뿐만 아니라 곰팡이도 감염시킬 수 있지만, 식물과 달리, 곰팡이는 아그로박테륨을 유발하는데 필요한 페놀 화합물을 분비하지 않기 때문에 아세토시링곤의 [56]형태로 첨가되어야 한다.
  • 곰팡이 속 작은 RNA의 발현 시스템 개발 덕분에 곰팡이 세포에 CRISPR/CAS9 시스템의 도입이 [56]가능해졌다.2016년 USDA는 과일 본체 갈색을 방지하기 위해 CRISPR/CAS9로 편집한 화이트 버튼 버섯 품종을 규제하지 않겠다고 선언하여 CRISPR/CAS9로 편집한 작물을 시장에 [58]출시하는 것에 대한 광범위한 논의를 야기했습니다.
  • 전기공법, 생물학, 초음파에 의해 생성된 기포의 캐비테이션을 이용하여 세포막을 투과시키는 소노포레이션 등 물리적인 방법도 [59]균류에 적용할 수 있다.

동물

동물 세포에 DNA를 도입하는 것은 보통 트랜스펙션이라고 불리며, 대응하는 기사에서 논의된다.

분자생물학에서의 변환의 실용적인 측면

상세 정보:변환 효율

박테리아에서 인위적으로 유도된 능력을 발견함으로써 대장균과 같은 박테리아가 단백질 발현뿐만 아니라 DNA를 조작하는 데 편리한 숙주로 사용될 수 있게 되었다.일반적으로 플라스미드는 대장균의 형질전환에 사용된다.세포 내에서 안정적으로 유지되기 위해 플라스미드 DNA 분자는 세포 자신의 염색체 복제와는 독립적으로 세포 내에서 복제될 수 있는 복제의 기원을 포함해야 한다.

유능한 배양기가 외인성 DNA를 흡수하여 유전자를 발현할 수 있는 효율은 변환 효율로 알려져 있으며 사용된 μg DNA당 콜로니 형성 단위(cfu)로 측정된다.pUC19와 같은 소플라스미드에 대한 1×10cfu8/μg의 변환효율은 변환된 플라스미드의 분자 2000분의 1과 거의 동등하다.

염화칼슘 변환에서는 Ca(CaCl 용액 중)가
2 존재하는 상태에서 세포를2+
냉각시킴으로써 세포를 플라스미드 DNA에 투과하게 한다.세포는 DNA와 함께 얼음에서 배양된 후 잠시 열 충격을 받는다(예: 42°C에서 30–120초간).이 방법은 원형 플라스미드 DNA에 매우 효과적이다.비상업적 제제는 보통 플라스미드 마이크로그램당 10~10개의7 변성체를 제공해야6 한다.나쁜 제제는 약 104/μg 이하이지만, 유능한 세포를 잘 준비하면 플라스미드 [60]마이크로그램당 최대8 10개의 군집을 만들 수 있다.그러나 10개 [61]이상의9 변환 효율을 낼 수 있는 초능력 셀을 만들기 위한 프로토콜이 존재합니다.그러나 이 화학적 방법은 염색체 DNA 조각과 같은 선형 DNA에는 잘 작동하지 않는데, 아마도 세포의 고유 핵산가수분해효소 효소가 선형 DNA를 빠르게 분해하기 때문일 것이다.대조적으로, 선천적으로 유능한 세포는 보통 플라스미드 DNA보다 선형 DNA로 더 효율적으로 변환된다.

CaCl
2 방법을 사용한 변환 효율은 플라스미드 크기에 따라 감소하므로 전기처리가 큰 플라스미드 DNA의 [62]흡수에 더 효과적인 방법일 수 있다.전기에 사용되는 셀은 먼저 차가운 이중 증류수로 세척하여 전기에 의해 불꽃이 발생할 수 있는 하전 입자를 제거해야 합니다.

플라스미드 변환 선택 및 선별

변환은 보통 비교적 적은 수의 변환 세포와 풍부한 비변환 세포의 혼합물을 생성하기 때문에 플라스미드를 [63]획득한 세포를 선택하는 방법이 필요하다.따라서 플라스미드는 플라스미드가 없는 세포들이 죽거나 성장을 멈출 수 있도록 선택 가능한 마커를 필요로 한다.항생제 내성은 원핵생물에게 가장 일반적으로 사용되는 지표이다.변형 플라스미드는 박테리아가 민감하게 반응하는 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 포함하고 있다.처리된 세포의 혼합물은 변형된 세포만이 자랄 수 있도록 항생제를 함유한 배지에서 배양된다.또 다른 선택 방법은 특정 아미노산, 뉴클레오티드 또는 당을 대사하지 못하는 것을 보상할 수 있는 특정 보조 영양 마커를 사용하는 것입니다.특정 생체분자의 합성이나 효용성이 결여된 적절한 돌연변이 균주의 사용이 필요하며, 변환된 세포는 플라스미드를 포함한 세포만 성장할 수 있는 배지에서 배양된다.

복제 실험에서 형질전환에 사용되는 플라스미드에 유전자를 삽입할 수 있다.그러나 이러한 실험에서 모든 플라스미드가 성공적으로 삽입된 유전자를 포함하지는 않을 수 있습니다.따라서 삽입물과 함께 플라스미드를 포함하는 변형 세포를 선별하기 위해 추가 기법을 사용할 수 있습니다.리포터 유전자는 청백 스크리닝에 사용되는 β-갈락토시다아제를 코드하는 lacZ 유전자와 같이 마커로 사용될 수 있다.이 스크리닝 방법은 플라스미드 내의 lacZ 유전자(lacZα) 조각이 세포 내의 또 다른 돌연변이 lacZ 유전자(lacZδM15)를 보완할 수 있는 α-보완 원리에 의존한다.두 유전자는 그 자체로 비기능성 펩타이드를 생성하지만, lacZ-α를 포함한 플라스미드가 lacZδM15 세포로 변환되면 기능성 β-갈락토시다아제를 형성한다.활성β-갈락토시드가수분해효소의 존재는 세포가 X-gal을 포함한 판에서 성장하여 특징적인 청색 집락을 형성할 때 검출될 수 있다.그러나 관심 유전자가 플라스미드 벡터에 결합될 수 있는 다중 복제 부위는 lacZα 유전자 내에 위치한다.따라서 결찰에 성공하면 lacZα 유전자가 교란되고 기능성 β-갈락토시드가수분해효소가 형성되지 않아 백색 콜로니가 형성된다.성공적으로 연결된 삽입물을 포함하는 세포는 성공하지 못한 파란색 삽입물과 흰색을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다.

일반적으로 사용되는 다른 리포터 유전자는 푸른 빛 아래에서 녹색으로 빛나는 세포를 생성하는 녹색 형광 단백질과 빛을 내기 위해 루시페린과 반응을 촉매하는 효소 루시페라아제이다.또한 재조합 DNA는 방사성 RNA 프로브에 의한 핵산 교배와 같은 다른 방법을 사용하여 검출될 수 있으며, 플라스미드에서 원하는 단백질을 발현한 세포도 면역학적 방법을 사용하여 검출될 수 있다.

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외부 링크

  • 세균 변환(플래시 애니메이션)
  • "준비, 조준, 발사!"포츠담-골름의 막스플랑크 분자식물생리학연구소에서는 입자총을 이용해 세포들을 '폭탄' 처리한다.