유전공학기술

Genetic engineering techniques
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유전공학
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유전자변형생물
역사와 규정
과정
적용들
논란

유전공학은 여러 가지 기법을 사용하여 성취될 수 있다. 유전자 변형 유기체(GMO)가 만들어지기 전에 따라야 할 여러 단계가 있다. 유전공학자는 먼저 어떤 유전자를 삽입, 수정 또는 삭제할지를 선택해야 한다. 그런 다음 이 유전자는 다른 유전적 요소들과 함께 분리되어 적절한 벡터로 통합되어야 한다. 그리고 나서 이 벡터는 유전자를 숙주 게놈에 삽입하는데 사용되어 유전자 변형이나 편집된 유기체를 만든다. 유전자를 조작하는 능력은 유전자가 어떻게 기능하고 어떻게 우리가 그것들을 조작할 수 있는지에 대한 수년간의 연구와 발견에 기초하여 구축된다. 중요한 발전은 제한 효소와 DNA 연대의 발견과 중합효소 연쇄 반응과 염기서열 개발이었다.

이것은 관심 유전자를 분리시킨 다음 벡터로 통합할 수 있게 했다. 종종 선택 가능한 마커 유전자와 더불어 프로모터 및 터미네이터 지역이 추가되었다. 이 유전자는 이 시점에서 더 효과적으로 표현하기 위해 변형될 수 있다. 그리고 나서 이 벡터는 숙주 유기체의 게놈에 삽입된다. 동물의 경우, 이 유전자는 전형적으로 배아줄기세포에 삽입되는 반면, 식물에서는 완전히 발달한 식물로 배양될 수 있는 어떤 조직에도 삽입될 수 있다. 일반적인 기법으로는 미세주사, 바이러스 매개, 아그로박테리움 매개 또는 생물학 등이 있다. 결과 유기체에 대한 추가 검사를 수행하여 안정된 통합, 상속 및 표현을 보장한다. 1세대 자손은 이질형이며, 안정적인 유산에 필요한 동질성 패턴을 생성하기 위해 잉여를 필요로 한다. 동질성은 2세대 표본에서 확인되어야 한다.

전통적인 기술들은 숙주의 게놈에 유전자를 무작위로 삽입했다. 발전은 유전자가 게놈 내의 특정 위치에 삽입될 수 있게 해 주었고, 이것은 무작위 삽입의 의도하지 않은 부작용을 감소시킨다. 초기 표적 시스템은 메가뉴클레아제와 아연 핑거핵에 의존했다. 2009년부터 보다 정확하고 구현하기 쉬운 시스템이 개발되었다. 전사 활성제 유사 이펙터 핵(ALEN) 및 Cas9-guideRNA 시스템(CRISPR에서 채택)은 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 시스템이다. 그것들은 유전자 치료와 정확하거나 높은 처리량 타겟팅이 필요한 다른 절차에서 잠재적으로 유용할 수 있다.

역사

참고 항목: 유전공학사

많은 다른 발견과 발전이 유전공학의 발전으로 이어졌다. 인간 주도의 유전자 조작은 기원전 약 12,000년에 인위적인 선택을 통해 동식물을 가축화하는 것에서 시작되었다.[1]: 1 다양한 기술들이 번식하고 선택하는데 도움을 주기 위해 개발되었다. 혼성화는 유기체의 유전자 구성에 급격한 변화가 도입될 수 있는 한 가지 방법이었다. 농작물 잡종화는 인간이 관련 종의 유전적으로 뚜렷한 개인을 근접하게 성장시키기 시작했을 때 처음 일어났을 가능성이 높다.[2]: 32 어떤 식물들은 식물성 복제로 번식할 수 있었다.[2]: 31

유전적 유산은 1865년 그레고르 멘델에 의해 완두콩을 가로지르는 실험을 거쳐 처음 발견되었다.[3] 1928년 프레드릭 그리피스는 오스왈드 에이버리, 콜린 맥리드, 매클린 매카티 등에 의해 1944년 DNA로 확인된 상속과 관련된 '변환원리'의 존재를 증명했다. 프레데릭 생거는 1977년에 DNA 염기서열 분석법을 개발하여 연구자들이 이용할 수 있는 유전자 정보를 크게 늘렸다.

DNA의 존재와 성질을 발견한 후, DNA를 조작할 수 있는 도구를 개발해야 했다. 1970년에 Hamilton Smiths 연구소는 제한 효소를 발견하여 과학자들이 유기체의 게놈에서 유전자를 분리할 수 있게 했다.[4] 부서진 DNA와 함께 결합하는 DNA 묶음은 1967년 일찍이 발견되었다.[5] 두 효소를 결합함으로써 재조합 DNA를 만들기 위해 DNA 시퀀스를 "잘라서 붙이는" 것이 가능해졌다. 1952년에 발견된 플라스미드는 세포간 정보를 전달하고 DNA 서열을 복제하는 중요한 도구가 되었다.[6] 1983년 케리 멀리스가 개발한 중합효소 연쇄반응(PCR)은 DNA의 소부분이 증폭(복제)되고 유전물질의 식별과 격리가 가능하도록 했다.

DNA를 조작하는 것뿐만 아니라, 유기체의 게놈에 삽입하기 위한 기술도 개발되어야 했다. 그리피스의 실험은 이미 일부 박테리아가 외국인의 DNA를 자연적으로 흡수하고 표현할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 1970년 대장균에서 염화칼슘 용액(CaCl2)으로 처리해 인공적인 역량이 유도됐다.[7] 1980년대 후반에 전기공학을 이용한 변형이 개발되어 효율성과 세균범위를 높였다.[8] 1907년에 식물 종양을 일으킨 박테리아인 아그로박테리움 투메파시엔스가 발견되었다. 1970년대 초에 이 박테리아가 티 플라스미드를 사용하여 식물에 DNA를 삽입한 것이 발견되었다.[9] 종양을 일으킨 플라스미드에 있는 유전자를 제거하고 새로운 유전자를 추가함으로써, 연구원들은 식물을 A. 종양에 감염시킬 수 있었고 박테리아가 선택한 DNA를 식물의 게놈에 삽입하도록 할 수 있었다.[10]

표적 유전자 선택

첫 번째 단계는 숙주 유기체에 삽입할 대상 유전자나 유전자를 식별하는 것이다. 이것은 결과 유기체에 대한 목표에 의해 추진된다. 어떤 경우에는 한두 개의 유전자만 영향을 받는다. 좀 더 복잡한 목표를 위해 여러 유전자를 포함하는 전체 생합성 경로가 포함될 수 있다. 일단 광범위한 유기체로부터 유전자와 다른 유전 정보가 발견되면, 저장과 수정을 위해 박테리아에 삽입될 수 있고, 그 과정에서 유전적으로 조작된 박테리아를 만들어낼 수 있다. 박테리아는 값이 싸고, 재배가 쉽고, 클론, 증식이 빠르고, 변환이 비교적 용이하며, 거의 무한정 -80 °C에서 저장할 수 있다. 일단 유전자가 분리되면 그것은 박테리아 안에 저장될 수 있어 연구를 위한 무제한 공급을 제공한다.[11]

유전자 화면은 잠재적인 유전자를 판별하기 위해 수행될 수 있으며, 그 다음에 가장 적합한 후보를 식별하는 다른 테스트가 뒤따른다. 간단한 화면은 화학 물질이나 방사선으로 DNA를 무작위로 변이시킨 다음 원하는 특성을 나타내는 것을 선택하는 것이다. 돌연변이가 실용적이지 않은 유기체를 위해 과학자들은 대신 자연적으로 발생하는 돌연변이를 통해 그 특징을 나타내는 개체군 중에서 개인을 찾는다. 표현형을 보고 나서 책임유전자를 규명하는 과정을 전진유전학이라고 한다. 그리고 나서 그 유전자는 알려진 유전자 표지와 표현형의 유산을 비교함으로써 지도화 될 필요가 있다. 서로 가까운 유전자는 함께 유전될 가능성이 높다.[12]

또 다른 선택은 역유전학이다. 이 접근법은 돌연변이를 가진 특정 유전자를 대상으로 한 다음 어떤 표현형이 발달하는지 관찰하는 것을 포함한다.[12] 이 돌연변이는 유전자를 불활성화시키거나 특정 조건에서만 활성화되도록 설계될 수 있다. 조건부 돌연변이는 정상적으로 기능하지 않을 경우 치명적인 유전자를 식별하는 데 유용하다.[13] 유사한 기능을 가진 유전자가 유사한 염기서열(동음이의)을 공유하기 때문에, 유전자의 염기서열을 모형 유기체로부터 잘 연구된 유전자의 염기서열과 비교함으로써 유전자의 발생 가능한 함수를 예측할 수 있다.[12] 미세조영, 대본, 게놈 염기서열의 발달로 바람직한 유전자를 찾는 것이 훨씬 쉬워졌다.[14]

바실러스 튜링겐시스균은 누에가 죽은 1901년 원인 물질로 처음 발견되었다. 이러한 살충제 특성 때문에, 이 박테리아는 1938년에 상업적으로 개발된 생물학적 살충제로 사용되었다. 극저온 단백질은 1956년에 살충제 활동을 제공하는 것으로 발견되었고, 1980년대까지 과학자들은 성공적으로 이 단백질을 암호화하는 유전자를 복제하여 식물로 표현했다.[15] 제초제 글리포세이트에 저항력을 제공하는 유전자가 몬산토 라운드업 제조시설의 유출 파이프에 사는 박테리아를 7년간 수색한 끝에 발견됐다.[16] 동물에서 사용되는 유전자의 대부분은 성장 호르몬 유전자다.[17]

유전자 조작

모든 유전공학 과정은 DNA의 수정을 포함한다. 전통적으로 DNA는 유기체의 세포로부터 격리되었다. 후에, 유전자는 DNA 도서관이 만들어지거나 인공적으로 합성된 후에 DNA 부분에서 복제되기 시작했다. 일단 분리되면, 유전자에 추가적인 유전적 요소가 추가되어 숙주 유기체에서 발현될 수 있게 하고 선택을 돕는다.

세포에서 추출

주요기사 : DNA추출

먼저 세포는 부드럽게 열려야 하며 DNA에 큰 손상을 입히지 않고 노출되어야 한다. 사용되는 방법은 세포의 종류에 따라 다르다. 일단 그것이 열리면, DNA는 다른 세포 구성 요소로부터 분리되어야 한다. 파열된 세포는 단백질과 다른 세포 파편을 포함하고 있다. 페놀 및/또는 클로로포름과 혼합한 후 원심분리하여 핵산을 이 잔해로부터 상부 수용상 위상으로 분리할 수 있다. 이 수용 단계는 페놀-클로로폼 단계를 반복하여 필요 시 제거 및 추가 정화가 가능하다. 핵산은 에탄올이나 이소프로판올을 사용하여 수용액에서 침전될 수 있다. 어떤 RNA도 리보뉴클레스를 첨가하면 그것을 분해할 수 있다. 현재 많은 기업들이 이 과정을 단순화하는 키트를 판매하고 있다.[18]

유전자 격리

관심 유전자는 추출된 DNA로부터 분리되어야 한다. 만약 그 염기서열을 알 수 없다면, 일반적인 방법은 무작위 소화법으로 DNA를 분해하는 것이다. 이것은 보통 제한 효소(DNA를 자르는 효소)를 사용하여 이루어진다. 부분 제한 다이제스트는 일부 제한 부위만 절단해 DNA 조각이 겹치는 결과를 낳는다. DNA 조각들은 개별 플라스미드 벡터에 넣어 박테리아 안에서 자란다. 일단 박테리아에 들어가면 박테리아가 분열하면서 플라스미드가 복사된다. 특정 조각에 유용한 유전자가 존재하는지 판단하기 위해 DNA 라이브러리에서 원하는 표현형을 선별한다. 표현형이 검출되면 박테리아에 표적 유전자가 들어 있을 가능성이 있다.

유전자가 검출 가능한 표현형을 가지고 있지 않거나 DNA 라이브러리에 올바른 유전자가 포함되어 있지 않다면, 이를 분리하기 위해 다른 방법을 사용해야 한다. 만약 분자 표지를 사용하여 유전자의 위치를 결정할 수 있다면, 염색체 걷기는 올바른 DNA 조각을 분리하는 한 방법이다. 만약 이 유전자가 다른 종의 알려진 유전자에 가까운 호몰로지를 표현한다면, 도서관에서 알려진 유전자와 밀접하게 일치하는 유전자를 찾음으로써 고립될 수 있다.[19]

알려진 DNA 염기서열은 유전자의 양쪽에 있는 DNA를 절단하는 제한효소를 사용할 수 있다. 그리고 나서 젤 전기영양증은 그 조각들을 길이에 따라 분류한다.[20] 일부 겔은 하나의 베이스 페어로 다른 시퀀스를 분리할 수 있다. DNA는 브롬화 에티듐으로 염색을 하고 자외선을 받아 사진을 찍으면 시각화가 가능하다. 각 띠의 크기를 추정하기 위해 DNA 옆에 길이가 알려진 마커를 둘 수 있다. 정확한 크기의 DNA 밴드는 겔로부터 배설될 수 있는 유전자를 포함해야 한다.[18]: 40–41 알려진 염기서열의 유전자를 분리하는 또 다른 기술은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 포함한다.[21] PCR은 주어진 염기서열을 증폭시킬 수 있는 강력한 도구로, 그 다음 젤 전기공격을 통해 분리될 수 있다. 그것의 효과는 더 큰 유전자와 함께 떨어지고 그것은 그 수열에 오류를 발생시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있다.

인공적으로 유전자를 합성하는 것이 가능하다.[22] 일부 합성 시퀀스는 상업적으로 이용 가능하며 이러한 초기 단계의 많은 부분을 포기한다.[23]

수정

삽입할 유전자는 다른 유전적 원소와 결합해야 제대로 작동할 수 있다. 이 유전자는 이 단계에서 더 나은 표현이나 효과를 위해 변형될 수 있다. 삽입될 유전자뿐만 아니라 대부분의 구조물은 선택 가능한 마커 유전자와 더불어 촉진자 및 종료자 영역을 포함한다. 발기인 부위는 유전자의 전사를 개시하여 유전자 발현 위치와 수준을 제어하는 데 사용할 수 있으며, 터미네이터 부위는 전사를 종료한다. 대부분의 경우 항생제 내성을 나타내는 선택 가능한 표식은 어떤 세포가 새로운 유전자로 변형되는지를 결정하는 데 사용된다. 구조물은 제한 소화, 결합, 분자 복제와 같은 재조합 DNA 기법을 사용하여 만들어진다.[24]

호스트 게놈에 DNA 삽입

주요 기사: 유전자 전달

일단 유전자가 생성되면 대상 유기체의 게놈에 안정적으로 통합되거나 세포외 DNA로 존재해야 한다. 숙주 게놈에 유전자를 삽입하는 데 사용할 수 있는 기술은 여러 가지가 있으며, 대상 유기체의 종류에 따라 다르다. 다세포 eukaryotes에서, 만약 트랜스젠이 숙주의 생식선 세포에 통합된다면, 결과적인 호스트 세포는 트랜스젠을 그것의 자손에게 전달할 수 있다. 트랜스젠이 체세포에 편입되면 트랜스젠은 유전될 수 없다.[25]

변환

주요 기사: 변환(유전자)
박테리아 변형은 한 박테리아에서 다른 박테리아로 유전자를 옮기는 것을 포함한다. 그것은 수령인 플라스미드에 통합되어 있다. 그리고 나서 새로운 호스트로 표현될 수 있다.

변형은 세포막을 통해 유전 물질을 전달함으로써 세포의 유전적 성분을 직접 변화시키는 것이다. 약 1%의 박테리아가 자연스럽게 외래 DNA를 차지할 수 있지만, 이 능력은 다른 박테리아에서 유도될 수 있다.[26] 열충격이나 전기로 이 박테리아를 강조하면 세포막을 DNA에 침투시킬 수 있으며, 이는 게놈에 통합되거나 세포외 DNA로 존재할 수 있다. 일반적으로 세포는 열 펄스(열 쇼크)에 노출되기 전에 추운 조건 하에서 이중 양이 포함된 용액(종종 염화칼슘)에 배양된다. 염화칼슘은 세포막을 부분적으로 교란시켜 재조합 DNA가 숙주세포로 들어갈 수 있게 한다. 차가운 상태에서 분열된 양이온에 세포를 노출시키면 세포 표면 구조가 바뀌거나 약해져 DNA에 더 투과될 수 있다고 제안한다. 열 맥박은 세포막을 가로질러 열 불균형을 일으켜 DNA가 세포의 모공이나 손상된 세포벽을 통해 세포 안으로 들어가도록 하는 것으로 생각된다. 전기회전은 능력을 촉진하는 또 다른 방법이다. 이 방법에서 세포는 10-20 kV/cm의 전기장으로 잠시 충격을 받게 되는데, 이것은 플라스미드 DNA가 들어갈 수 있는 세포막에 구멍을 만들어 내는 것으로 생각된다. 감전 후, 그 구멍들은 세포의 막-수리 메커니즘에 의해 빠르게 닫힌다. 새로 얻은 DNA는 박테리아 게놈과 통합되거나 더 일반적으로는 세포외 DNA로 존재할 수 있다.

유전자 총은 식물 조직에 DNA를 삽입하기 위해 생물학을 사용한다.
A. 당근 세포에 달라붙는 투메파시엔스

식물에서 DNA는 식물 세포에 유전 물질을 자연적으로 삽입할 수 있는 아그로박테리움 T-DNA 시퀀스를 이용하여 아그로박테리움 매개 재조합을 사용하여 삽입되는 경우가 많다.[27][28] 식물 조직은 잘게 썰어 매달린 아그로박테리움이 함유된 액체에 담가진다. 이 박테리아는 베인 상처에 의해 노출된 많은 식물 세포에 부착될 것이다. 이 박테리아는 T-DNA라고 불리는 DNA 부분을 플라스미드에서 식물로 옮기기 위해 결합을 사용한다. 전달된 DNA는 식물 세포핵으로 조종되어 숙주 식물 유전체 DNA에 통합된다.플라스미드 T-DNA는 호스트 세포의 게놈에 반 무작위로 통합된다.[29]

관심 유전자를 표현하기 위해 플라스미드를 수정함으로써, 연구원들은 선택한 유전자를 식물 게놈에 안정적으로 삽입할 수 있다. T-DNA의 유일한 필수 부품은 두 개의 작은(25개의 기본 쌍) 경계 반복이며, 그 중 적어도 하나는 식물 변환에 필요하다.[30][31] 이 식물에 도입될 유전자는 플라스미드의 T-DNA 영역을 포함하는 식물 변환 벡터로 복제된다. 대안적인 방법은 농업적응이다.[32][33]

식물 세포를 변형시키는데 사용되는 또 다른 방법은 생물학인데, 금이나 텅스텐의 입자들이 DNA로 코팅된 후 어린 식물 세포나 식물 배아에 주입된다.[34] 어떤 유전적 물질은 세포에 들어가 그것들을 변형시킨다. 이 방법은 아그로박테리움 감염에 취약하지 않은 식물에 사용할 수 있으며 식물 플라스티드의 변형이 가능하다. 식물 세포는 또한 전기작용을 이용하여 변형될 수 있는데, 이것은 세포막을 플라스미드 DNA에 스며들게 하기 위해 전기 충격을 이용한다. 세포와 DNA에 의한 손상으로 인해 생물학적, 전기적 변환의 변환 효율이 농균 변환보다 낮다.[citation needed]

전염

주요 기사: 전염

변형은 동물과 관련하여 다른 의미를 가지고 있어 암 상태로의 진행을 나타내기 때문에 보통 동물 세포에 외래 DNA를 삽입하는 데 사용되는 과정을 전염이라고 한다.[35] 체외에서 동물 세포에 DNA를 직접 도입하는 방법에는 여러 가지가 있다. 종종 이 세포들은 유전자 치료에 사용되는 줄기세포들이다. 화학 기반 방법은 천연 화합물이나 합성 화합물을 사용하여 유전자가 세포로 전달되는 것을 촉진하는 입자를 형성한다.[36] 이러한 합성 벡터는 DNA를 결합하고 큰 유전적 전달을 수용할 수 있는 능력을 가지고 있다.[37] 가장 간단한 방법 중 하나는 인산칼슘을 사용하여 DNA를 결합한 다음 배양된 세포에 노출시키는 것이다. 이 용액은 DNA와 함께 세포에 의해 캡슐화된다.[38] 지질학자와 중합체는 배양된 동물 세포에 DNA를 전달하기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 양전하 지피오솜은 DNA와 결합하고, 중합체는 DNA와 상호작용을 하도록 설계할 수 있다.[36] 그들은 각각 지엽과 다낭을 형성하고, 세포에 의해 흡수된다. 다른 기법으로는 전기공학과 생물학을 사용하는 것이 있다.[39] 어떤 경우에는, 전이된 세포가 외부 DNA를 자신의 게놈에 안정적으로 통합할 수 있는데, 이 과정은 안정적인 전이라고 알려져 있다.[40]

유전자이전 동물을 만들려면 DNA를 실행 가능한 배아나 난자에 삽입해야 한다. 이것은 보통 세포의 핵 봉투를 통해 핵으로 직접 DNA를 주입하는 미세주사를 사용하여 이루어진다.[26] 초배란 수정란은 단일 세포 단계에서 채취하여 체외 배양한다. 정자 머리와 난자의 프로뉴클레아가 원형을 통해 보이면 그 중 하나에 유전 물질이 주입된다. 그리고 난모세포는 기면동물 난소에 이식된다.[41] 또 다른 방법은 배아줄기세포 매개 유전자 전이다. 이 유전자는 배아줄기세포에 전이된 후 생쥐 배반구에 삽입되어 수양모세포에 이식된다. 그 결과로 생긴 자손은 치메릭이고, 더 나아가 짝짓기를 하면 관심 유전자와 완전히 유전자를 가진 쥐를 생산할 수 있다.[42]

전도가

주요 기사: 전이(유전자)

전도는 외래 DNA가 바이러스나 바이러스 벡터에 의해 세포에 유입되는 과정이다.[43] 유전자 변형 바이러스는 유전자 치료에서 표적 유전자를 다른 유기체로 옮기는 바이러스 벡터로 사용될 수 있다.[44] 먼저 바이러스에서 치명적인 유전자를 제거하고 대상 유전자를 대신 삽입한다. 바이러스가 숙주 유기체에 유전자를 삽입할 수 있는 순서는 그대로 두어야 한다. 인기 있는 바이러스 벡터는 역바이러스와 아데노바이러스에서 개발된다. 벡터로 사용되는 다른 바이러스로는 렌즈 바이러스, 양두 바이러스, 대상 바이러스 등이 있다. 사용되는 바이러스의 종류는 대상 세포와 DNA가 영구적으로 또는 일시적으로 변경되는지에 따라 달라질 것이다.

재생

종종 단 하나의 세포만이 유전 물질로 변형되듯이, 그 유기체는 그 단일 세포로부터 재생되어야 한다. 식물에서 이것은 조직 배양기의 사용을 통해 이루어진다.[45][46] 식물 종마다 성공적인 재생에 대한 요구사항이 다르다. 만약 성공한다면, 이 기술은 모든 세포에 트랜스젠이 들어 있는 성인 식물을 생산한다.[47] 동물의 경우 삽입된 DNA가 배아줄기세포에 존재하는지 확인할 필요가 있다.[27] 자손은 유전자를 검사할 수 있다. 1세대의 모든 자손은 삽입된 유전자에 대해 이질성이며 균질성 표본을 생성하기 위해 삽입되어야 한다.[citation needed] 박테리아는 단일 세포로 구성되며 클론적으로 번식하므로 재생이 필요하지 않다. 선택 가능한 마커는 변형된 세포와 쉽게 구별하기 위해 사용된다.

DNA로 성공적으로 변형된 세포는 표식 유전자를 포함하고 있는 반면, 변형되지 않은 세포는 그렇지 않을 것이다. 그 유전자를 발현하는 세포를 선택하거나 표시하는 항생제나 화학물질이 있는 곳에서 세포를 성장시킴으로써 변형되지 않은 세포와 변형된 세포를 분리할 수 있다. 또 다른 선별 방법은 삽입된 유전자에만 달라붙는 DNA 탐침을 포함한다. 성숙된 유전자 변형 식물에서 선택 가능한 마커를 제거할 수 있는 여러 가지 전략이 개발되었지만, 이러한 마커들은 보통 유전자 변형 유기체에 존재한다.[48]

컨펌프

재조합 유기체가 삽입된 유전자를 포함하고 있다는 것을 발견하는 것은 일반적으로 그것들이 의도된 조직에서 적절하게 표현될 수 있도록 하기에는 충분하지 않다. PCR, Southern Hybridization, DNA 염기서열을 이용한 추가 테스트를 통해 유기체가 새로운 유전자를 포함하고 있는지 확인한다.[49] 또한 이러한 테스트는 삽입된 유전자의 염색체 위치와 복사 번호를 확인할 수 있다. 일단 확인된 유전자 제품(RNA와 단백질)을 찾아 측정하는 방법 또한 유전자 발현, 전사, RNA 처리 패턴, 단백질 제품의 발현과 국산화 등을 평가하는 데 사용된다. 여기에는 북부 하이브리드화, 정량적 RT-PCR, Western Blot, 면역유동성, ELISA 및 표현파 분석이 포함된다.[50] 적절한 경우, 그 유기체의 자손을 연구하여 트랜스젠과 관련 표현형이 안정적으로 계승되고 있음을 확인한다.

유전자 삽입 타겟팅

주요 기사: 유전자 타겟팅 및 게놈 편집

전통적인 유전자 공학 방법은 일반적으로 새로운 유전 물질을 숙주 게놈 안에 무작위로 삽입한다. 이것은 유기체 내의 다른 유전자를 손상시키거나 바꿀 수 있다. 새로운 유전 물질을 유기체 게놈 내의 특정 부위에 삽입하는 방법이 개발되었다. 게놈 내의 특정 부위에서 유전자를 대상으로 한 초기 방법은 동질 재조합(HR)에 의존했다.[51] 표적 게놈 염기서열과 일치하는 템플릿이 들어 있는 DNA 구조물을 생성함으로써 세포 내의 HR 공정들이 원하는 위치에 구조물을 삽입할 가능성이 있다. 이 방법을 배아줄기세포에 사용함으로써 표적형 탈진(targeted knock out)을 가진 유전자 변형 생쥐가 개발되었다. 유전자를 노크하거나 유전자 발현 패턴을 바꾸는 것도 가능했다.[52]

만약 중요한 유전자가 도태된다면 그것은 그 유기체에 치명적일 수 있다. 이러한 유전자의 기능을 연구하기 위해 현장 고유재조합(SSR)이 사용되었다. 가장 일반적인 두 가지 유형은 Cre-LoxP와 Flp-FRT 시스템이다. 크레 재조합효소는 Lox-P 사이트로 알려진 결합 시퀀스 사이의 호몰로 재조합에 의해 DNA를 제거하는 효소다. Flip-FRT 시스템은 FRT 시퀀스를 인식하는 Flip 재조합 방식으로 작동한다. 관심 유전자를 옆에 두고 있는 재조합현장을 포함하는 유기체와 조직 특정 촉진자의 통제 하에 SSR을 표현하는 유기체를 교차시킴으로써 특정 세포에서만 유전자를 녹아웃시키거나 켜는 것이 가능하다. 이것은 또한 유전자이전 동물의 표식 유전자를 제거하는 데 사용되었다. 이러한 시스템을 추가로 수정함으로써 연구자들은 특정 조건에서만 재조합을 유도할 수 있게 되어 원하는 시기나 개발 단계에서 유전자를 녹아웃시키거나 발현할 수 있게 되었다.[52]

게놈 편집은 인공적으로 조작된 핵들을 사용하여 게놈의 원하는 위치에 특정한 이중 가닥의 균열을 만든다. 이 균열은 높은 빈도에서 표적 유전자 녹아웃, 보정 또는 삽입을 위해 악용될 수 있는 세포 DNA 수리 과정의 대상이다. 적절한 염기서열(호메로지)을 포함하는 기증자 DNA가 존재하는 경우, 트랜스젠을 포함하는 새로운 유전 물질은 균질 재조합에 의해 고효율의 표적 현장에 통합될 것이다.[53] 공학적 핵에는 네 가지 제품군이 있다: 메가뉴클레아제,[54][55] ZFN,[56][57] 전사 활성제 유사 이펙터 핵(TALEN),[58][59] 크리스퍼/캐스(정기적으로 클러스터된 짧은 팔린드로믹 반복/CRISPR 관련 단백질(예:[60][61] CRISPR/Cas9) 4종류 중 TALEN과 CRISPR/Cas가 가장 많이 사용된다.[62] 최근의 발전에서는 여러 시스템을 결합하여 양쪽의 가장 좋은 기능(예: 메가바이트)을 활용하는 것을 검토했다.TAL은 TALE DNA 결합 영역과 메가누클레스(meganuclease)를 융합한 것이다.[63] 최근의 연구도 이중의 좌초된 휴식(기본편집기)을 만들지 않고 유전자 조작이나 교정을 만드는 전략을 개발하는 데 초점을 맞추고 있다.[62]

메가뉴클레아제 및 아연 핑거핵제

메가뉴클레아제는 1988년 포유류 세포에서 처음 사용되었다.[64] 메가뉴클레아제는 긴 인식 부위가 있는 제한 효소 역할을 하는 엔도독시리보뉴클레아제로서 다른 제한 효소보다 대상 부지에 더 구체적이다. 이것은 게놈의 특이성을 높이고 게놈 내의 많은 사이트를 목표로 하지 않기 때문에 독성을 감소시킨다. 가장 많이 연구된 메가뉴클레아제는 LAGLIDADG 계열이다. 메가뉴클레아제는 여전히 다른 유전자 편집 도구에 비해 덜 매력적으로 보이는 오프타깃 바인딩에 상당히 취약하지만, 그들의 작은 크기는 여전히 바이러스 벡터화 관점에서는 특히 매력적으로 만든다.[65][53]

1996년에 처음으로 사용된 아연-손가락 핵(ZFN)은 일반적으로 아연-손가락 영역과 FokI nuclease 영역의 융합을 통해 생성된다. 따라서 ZFN은 표적지에서 DNA를 분리할 수 있는 능력을 가지고 있다.[53] 아연 핑거 도메인을 공학하여 게놈 내의 특정 사이트를 목표로 함에 따라 원하는 위치에서 게놈 시퀀스를 편집할 수 있다.[65][66][53] ZFN은 더 큰 특수성을 가지지만, 여전히 비특정 시퀀스에 바인딩할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 일정량의 비표적 갈라짐이 유전자 변형 모델 유기체를 만드는 데 허용되지만, 그것들은 모든 인간 유전자 치료법에 최적이지는 않을 수 있다.[65]

탈렌과 크리스퍼

2009년 전사 활성제 유사 효과제(TAL)에 의해 DNA 인식을 지배하는 코드에 대한 접근은 효율적인 TAL 기반 유전자 편집 도구의 새로운 클래스를 개발하는 길을 열었다. 크산토모나스 식물 병원체에 의해 분비되는 단백질인 TAL은 식물 숙주 내 유전자에 매우 특수성을 부여하고 감염을 돕는 유전자의 전사를 시작한다. DNA 결합 코어를 FokI nuclease 촉매 영역에 융합함으로써 엔지니어링 TALE는 디자이너 핵의 새로운 도구인 TALE nuclease(TALN)를 만들 수 있었다.[67] 그들은 현재 개발된 모든 핵들 중에서 가장 특별한 것 중 하나를 가지고 있다. 반복 시퀀스가 존재하기 때문에 표준 분자 생물학적 절차를 통해 구성하기 어렵고 골든 게이트 복제와 같은 보다 복잡한 방법에 의존한다.[62]

2011년에는 박테리아와 고고학에서 적응 면역 체계로서 기능하는 CRISPR/CAS(정기적으로 간격이 짧은 짧은 팔린드롬 반복/CRISPR 관련 단백질) 시스템을 기반으로 또 하나의 획기적인 기술이 개발되었다. CRISPR/Cas 시스템은 박테리아와 고세아가 바이러스 DNA를 분해하고 그 DNA의 일부를 그들 자신의 게놈에 삽입함으로써 침입 바이러스에 맞서 싸울 수 있도록 한다. 그리고 나서 이 유기체는 이 DNA를 RNA로 변환하고 이 RNA를 Cas9 단백질과 결합시켜 침입한 바이러스 DNA에 이중 가닥이 있는 파열을 만든다. RNA는 Cas9 효소를 바이러스 DNA의 정확한 지점으로 유도하는 가이드 RNA의 역할을 한다. Cas 단백질을 설계된 가이드 RNA CRISPR/Cas9와 결합함으로써 DNA 시퀀스 내의 특정 지점에서 이중 가닥 파단을 유도하는 데 사용할 수 있다. 그 휴식은 세포 DNA 수리 효소에 의해 수리되어 대부분의 경우 작은 삽입/삭제 유형의 돌연변이를 일으킨다. 표적형 DNA 수리는 원하는 변화를 나타내며 (때로는) 균질 재조합에 의한 이중 스트랜드 파손 수리에 사용되는 기증자 DNA 템플릿을 제공함으로써 가능하다. 크리스퍼/캐스9이 접시의 인간 세포를 편집할 수 있다는 것이 나중에 증명되었다. 초기 세대는 TALEN의 특수성이 부족하지만 이 기술의 가장 큰 장점은 디자인의 단순성이다. 또한 여러 사이트를 동시에 대상으로 할 수 있어 여러 유전자를 동시에 편집할 수 있다. CRISPR/Cpf1은 CRISPR/Cas9와 비교할 때 다른 가이드 RNA가 특정한 이중 가닥 균열(DNA를 클리어할 때 돌출)을 생성해야 하는 더 최근에 발견된 시스템이다.[62]

CRISPR/Cas9는 유전자 파괴에 효율적이다. 중국 연구원 Her Jiankui에 의한 HIV 내성 아기들의 탄생은 아마도 이 방법을 이용한 유전자 교란의 가장 유명한 예일 것이다.[68] 그것은 유전자 교정에 훨씬 덜 효과적이다. 염기 편집 방법은 유전자 표적에 '누실세-죽음' Cas 9 엔도누클리스 또는 관련 효소를 사용하는 반면 연계된 탈아미노효소 효소는 DNA에서 표적 염기변형을 하는 방식이다.[69] 가장 최근 CRISPR-Cas9의 정교함을 Prime Editing이라고 부른다. 이 방법은 RNA 유도 공학적 누클리스에 역성분해효소를 연결하는데, 이는 단일 가닥을 절단할 뿐 이중 가닥이 끊기지 않는 것이다. Nuclease와 reverse transcriptase의 연속적인 작용에 의해 절단 옆에 있는 DNA 부분을 대체하여 RNA 템플릿에서 원하는 변화를 도입한다.[70]

참고 항목

참조

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