유전자표적

Gene targeting
아구티 코트 컬러 유전자를 표적으로 하는 키메라 마우스 유전자와 그 자손들

유전자 타겟팅은 생물체의 DNA 서열을 바꾸는 데 사용되는 생명공학적 도구입니다.이것은 상동 재조합을 포함하여, 상동 직접 수리(HDR)의 자연 DNA 복구 메커니즘을 기반으로 합니다.유전자 타겟팅은 유기체에 완전히 새로운 유전자를 삽입하는 것과 같은 더 큰 DNA 편집에서부터 한 개의 염기쌍 변화와 같은 기존 DNA에 대한 훨씬 더 작은 변화에 이르기까지 다양한 크기의 DNA 편집을 만드는 데 사용될 수 있습니다.유전자 타겟팅은 DNA에 사용자 정의 편집을 도입하기 위해 복구 템플릿의 존재에 의존합니다.사용자(일반적으로 과학자)는 원하는 편집을 포함하도록 복구 템플릿을 설계하고, 사용자가 편집하고자 하는 DNA 영역에 대응하는(동종성) DNA 염기서열을 측면에 배치합니다. 따라서 편집은 특정 게놈 영역을 대상으로 합니다.이러한 방식으로 유전자 타겟팅은 자매 크로마티드의 '자연적' DNA 복구 템플릿이 손상된 DNA를 복구하는 데 사용되는 자연 상동성 지향 복구와는 구별됩니다(자매 크로마티드는 유전자의 두 번째 복사본입니다).생물체에서 DNA 염기서열의 변화는 예를 들어 유전자의 생물학적 역할을 이해하는 연구 맥락과 예를 들어 생물학에서 생물체의 특성을 변화시키는 데 모두 유용할 수 있습니다(예: 작물 식물을 개선하는 데).

방법들

야생형 피지코미트렐라 및 녹아웃이끼:유전자 파괴 라이브러리 변형에서 유도된 표현형의 편차.최소 Knop 배지에서 물리코미트렐라 야생형 및 형질전환 식물을 재배하여 분화 및 생식세포의 발달을 유도하였습니다.각 공장에 대해 개요(위쪽 행, 척도 막대는 1mm에 해당)와 근접(아래쪽 행, 척도 막대는 0.5mm에 해당)이 표시됩니다.A, 잎이 무성한 골풀과 야생형 잎의 클로즈업으로 완전히 덮여 있는 반로이드 야생형 이끼 식물.B-D,[1] 다른 돌연변이들.

유전자 표적 생물체를 만들기 위해서는 DNA가 세포에 도입되어야 합니다.이 DNA는 유전자 타겟팅을 완성하는데 필요한 모든 부분을 포함해야 합니다.적어도 이것은 상동성 복구 템플릿으로, 표적 영역(이 상동성 영역은 "상동성 암"이라고 함)과 동일한 DNA 상동성(순서대로 동일) 영역에 의해 측면에 배치된 원하는 편집을 포함합니다.GT가 실제로 발생한 세포(또는 "사건")를 식별하고 선택하는 데 도움이 되는 리포터 유전자 및/또는 선택 가능한 마커가 필요한 경우가 많습니다.또한 표적 DNA [2]영역에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 유발하여 GT 비율을 증가시키는 것이 일반적인 관례입니다.따라서 부위-특이적-핵 분해 효소를 암호화하는 유전자는 복구 템플릿과 함께 변형될 수 있습니다.GT에 필요한 이러한 유전적 요소들은 박테리아에서 기존의 분자 복제를 통해 조립될 수 있습니다.

유전자 표적화 방법은 여러 모델 생물에 대해 확립되어 있으며 사용되는 종에 따라 달라질 수 있습니다.쥐의 유전자를 표적으로 삼기 위해, DNA는 배양된 쥐의 배아 줄기 세포에 삽입됩니다.삽입된 세포는 배아 주입을 통해 마우스의 조직에 기여할 수 있습니다.마지막으로, 변형된 세포가 생식 기관을 구성하는 키메라 쥐가 번식합니다.이 단계 이후 마우스의 전체 몸은 선택된 배아줄기세포를 기반으로 합니다.

이끼 속의 유전자를 표적으로 삼기 위해 DNA는 새로 분리된 원형질과 폴리에틸렌 글리콜과 함께 배양됩니다.이끼는 반배체 [3]유기체이기 때문에, 이끼 필라멘트(프로톤에마)는 항생제 또는 PCR로 치료하여 표적을 직접 스크리닝할 수 있습니다.식물들 사이에서 독특하게, 역유전학을 위한 이 절차는 [4]효모에서처럼 효율적입니다.유전자 표적화는 소, 양, 돼지 그리고 많은 곰팡이에 성공적으로 적용되었습니다.

유전자 표적화의 빈도는 아연 손가락 [5]뉴클레오나아제, 엔지니어링 호밍 엔도뉴클레오나아제,[6] TALENS, 또는 가장 일반적으로 CRISPR-Cas 시스템과 같은 부위별 엔도뉴클레오나아제의 사용을 통해 상당히 향상될 수 있습니다.이 방법은 Drosophila melanogaster,[5] 담배,[7][8] 옥수수,[9] 인간 세포,[10] 쥐 그리고[11] [11]쥐를 포함한 종에 적용되어 왔습니다.

유전공학의 다른 형태와 비교

유전자 변형, 유전자 타겟팅 및 유전자 편집의 세 가지 유형의 '유전자 공학' 간의 관계를 보여주는 벤 다이어그램.

유전자 타겟팅, 유전자 편집 및 유전자 변형 사이의 관계는 아래 벤 다이어그램에 요약되어 있습니다.'유전공학'이 이 세 가지 기술을 모두 어떻게 아우르는지 보여줍니다.유전체 편집은 특정 위치에서 유전체를 약간 편집하는 것이 특징이며, 종종 [12]CRISPR와 같은 부위별-핵 분해 효소에 의해 대상 DNA 영역을 절단한 후에 수행됩니다.유전자 변형은 일반적으로 유전체 [13][14]내의 임의의 위치에 형질전환 유전자(외래 DNA, 즉 다른 종의 유전자)를 삽입하는 것을 설명합니다.유전자 표적화는 특정[2] 부위에서 유전체에 작은 변화를 가져올 수 있는 특정한 생명공학적 도구입니다. 이 경우 유전자 표적화로 인한 편집은 유전체 편집으로 간주됩니다.그러나 유전자 [15][16]타겟팅 중에 사용되는 상동성 복구 템플릿에 형질전환 유전자가 포함되면, 유전자 타겟팅은 타겟 부위에 전체 유전자(예: 형질전환 유전자)를 삽입할 수도 있습니다.이러한 경우 유전자 표적화로 인한 편집은 일부 관할 구역에서 외부 DNA 삽입이 [16]발생했기 때문에 유전자 변형과 동등한 것으로 간주됩니다.

유전자 타겟팅은 유전체 편집 도구의 한 구체적인 형태입니다.다른 유전체 편집 도구에는 표적 돌연변이 발생, 염기 편집 및 프라임 편집이 포함되며, 이들 모두 특정 유전체 [17][18]위치에 있는 내인성 DNA(생물에 이미 존재하는 DNA)에 대한 편집을 생성합니다.유전체 편집의 이러한 부위별 또는 '표적화된' 특성은 전형적으로 유전체 편집을 생물체의 게놈의 비특이적인 위치에 형질전환 유전자를 삽입하는 전통적인 '유전자 변형'과 다르게 만드는 것이며, 또한 생물체에 이미 존재하는 DNA에 작은 편집을 하는 유전자 편집을 하는 것입니다.구절 유전자 변형은 다른 [19][20]종의 '외래' DNA를 삽입하는 것입니다.

유전자 편집이 내생 DNA에 더 작은 변화를 주기 때문에, 유전자 편집을 통해 생성된 많은 돌연변이는 이론적으로 자연적인 돌연변이 발생을 통해 발생할 수도 있고, 식물의 맥락에서 발생할 수도 있습니다.전통적인 번식의 일부인 돌연변이 번식을 통해 (이와 대조적으로 유전자 변형 유기체(GMO)를 만들기 위한 형질 전환 유전자 삽입은 자연적으로 발생할 수 없었습니다).그러나 이 일반적인 규칙에는 예외가 있습니다. 서론에서 설명한 바와 같이 GT는 DNA에 가능한 크기의 편집 범위를 도입할 수 있습니다. 1개의 염기쌍을 변경, 삽입 또는 삭제하는 것과 같은 매우 작은 편집부터 이론적으로 전체 형질전환 [16]유전자의 삽입을 포함할 수 있는 훨씬 더 긴 DNA 염기서열을 삽입하는 것까지입니다.그러나 실제로는 GT가 더 작은 시퀀스를 삽입할 때 더 일반적으로 사용됩니다.GT를 통해 가능한 편집 범위는 규제하기 어려울 수 있습니다(규정 참조).

유전자 편집으로 이어지는 크리스퍼 절단 후 DNA 복구 결과 가능성.두 DNA 가닥 모두 크리스퍼-카스(또는 다른 부위별 핵산 분해 효소)에 의해 절단되어 이중 가닥 파괴(DSB)가 생성됩니다.그런 다음 DSB는 두 가지 대체 DNA 복구 경로(NHEJ 또는 HR)를 통해 복구되어 절단 부위에서 무작위 돌연변이("표적 돌연변이 발생") 또는 특정 편집을 포함하는 복구 템플릿이 제공되는 경우 특정 돌연변이로 이어집니다.

유전자 편집의 가장 확립된 두 가지 형태는 유전자 표적화와 표적 돌연변이 발생입니다.유전자 타겟팅은 상동성 재조합 DNA 복구 경로(HDR)에 의존하는 반면, 타겟팅 돌연변이 생성은 부서진 DNA의 비동동성-종단-접합(NHEJ)을 사용합니다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉬운 DNA 복구 경로로, 부서진 DNA를 복구할 때 DNA 염기를 삽입하거나 삭제할 수 있다는 것을 의미합니다.삽입 또는 삭제(인델)를 만듭니다.사용자는 이러한 랜덤 인델이 무엇인지 지정할 수 없으므로 대상 사이트에서 정확히 어떤 편집을 수행하는지 제어할 수 없습니다.그러나 표적 부위에서 DNA를 분해하기 위해 부위별 핵산 분해 효소(이전에는 Zinc Finger Nuclease & TALENs, 현재는 일반적으로 CRISPR)를 사용하여 이러한 편집이 발생할 위치를 제어할 수 있습니다.HDR(Homologous Recombination)을 통한 유전자 타겟팅 및 NHEJ를 통한 타겟팅 돌연변이 발생에 대한 요약은 아래 그림에 나와 있습니다.

CRISPR-Cas 방법을 기반으로 한 프라임 편집 및 베이스 [18]편집의 보다 새롭게 개발된 유전자 편집 기술은 유전자 타겟팅에 대한 대안이며, 이는 또한 표적 게놈 위치에서 사용자 정의 편집을 생성할 수 있습니다.그러나 각각은 가능한 DNA 염기서열 삽입 길이에 제한이 있습니다. 기본 편집은 단일 염기쌍 변환으로[21] 제한되는 반면 기본 편집은 최대 ~44bp의 [22][23]염기서열만 삽입할 수 있습니다.따라서 GT는 게놈 공학을 위한 긴 DNA 서열의 표적 (위치별) 삽입의 주요 방법으로 남아 있습니다.

유전자 포착과의 비교

유전자 트래핑은 카세트의 무작위 삽입을 기반으로 하는 반면, 유전자 타겟팅은 특정 유전자를 조작합니다.카세트는 여러 가지 다양한 용도로 사용될 수 있지만, 유전자 타겟팅 카세트의 측면 상동성 영역은 각 유전자에 맞게 조정되어야 합니다.이를 통해 대규모 프로젝트에서 유전자 트래핑을 표적화하는 것보다 더 쉽게 조정할 수 있습니다.반면, 유전자 타겟팅은 트랩 스크린에서 감지되지 않는 낮은 전사를 가진 유전자에 사용될 수 있습니다.포획 확률은 인트론 크기에 따라 증가하는 반면, 유전자 타겟팅의 경우, 작은 유전자도 마찬가지로 쉽게 변경됩니다.

적용들

포유류 시스템에서의 응용

유전자 [24]타겟팅은 1980년대에 포유류 세포에서 개발되었으며, 특히 쥐 [27]모델에서 유전자 기능 또는 인간 질병의 연구와 같은 표적 유전체 부위에서 특정 서열 변화를 만들 수 있는 결과로 다양한 응용이 가능했습니다.실제로 유전자 타겟팅은 관심있는 특정 돌연변이를 제거("knock out")하거나 추가("knock in")하여 인간의 유전 질환을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다.[28][29] 이전에 쥐 세포 [30][31]모델을 개발하는 데 사용되었던 유전자 타겟팅 기술의 발전은 새로운 이성질체 인간 질병 모델의 물결을 가능하게 합니다.이러한 모델은 연구자가 사용할 수 있는 가장 정확한 체외 모델이며 특히 [32]종양학에서 개인 맞춤형 약물 및 진단의 개발을 촉진합니다.유전자 타겟팅은 질병을 유발하는 돌연변이를 교정하기 위한 유전자 치료를 위해서도 연구되었습니다.그러나 이러한 문제를 [33]해결하기 위해 유전자 타겟팅을 위한 바이러스 벡터에 대한 연구가 수행됨에 따라, 유전자 타겟팅 기계를 세포로 전달하는 낮은 효율성이 이를 방해하고 있습니다.

효모와 이끼에서의 응용

유전자 표적화는 효모, 박테리아 및 이끼에서 비교적 높은 효율성을 갖지만 고등 진핵생물에서는 드물다.따라서 유전자 타겟팅은 이러한 시스템에서 유전자 기능을 연구하기 위한 역유전학적 접근에서 사용되어 왔습니다.

식물 유전체 공학에서의 응용

유전자 타겟팅(GT) 또는 호몰로지 지향 수리(HDR)는 식물 게놈 공학에서 특정 서열을 삽입하기 위해 일상적으로 사용되며, 1980년대 [40]식물에서 GT의 첫 번째 발표된 예입니다.그러나, 유전자 타겟팅은 고등 식물에서 상동 재조합(Homologous Recombination), 즉 상동학 지향 수리(Homology Directed Repair)의 낮은 비율과 많은 식물 [41]종에 의한 낮은 변환율(DNA 흡수) 때문에 특히 고등 식물에서 어려운 일입니다.그러나, 식물 유전체 공학을 위해 식물 유전체에 특정한 서열을 도입할 수 있는 것이 매우 유용하기 때문에, 지난 수십 [42][41][43][44]년 동안 식물에서 유전자 타겟팅의 빈도를 증가시키기 위한 많은 노력이 있었습니다.위에서 설명한 바와 같이, 식물에서 유전자 표적 빈도에 대한 가장 중요한 개선은 CRISPR와 같은 부위 특이적 핵효소를 통한 이중 가닥 파괴 유도였습니다.다른 전략으로는 식물 유전자 타겟팅이 있습니다따라서 상동성 복구 템플릿은 식물 게놈 내에 내장된 다음 CRISPR [45]절단을 사용하여 해방됩니다. 상동성 재조합 경로에 관련된 유전자의 상향 조절, 경쟁적인 Non-Homologous-End-Joining [46]경로의 하향 조절, 상동성 복구 [47]템플릿의 복사 수 증가 및 엔지니어링 Cas 변형은 o입니다.식물 조직 [48]배양에 최적화되어 있습니다.이러한 접근법 중 일부는 포유동물 [49]세포에서 유전자 타겟팅 효율성을 향상시키기 위해 사용되기도 했습니다.

유전자 표적이 된 식물은 아라비놉시스 탈리아나(가장 일반적으로 사용되는 모델 식물), 쌀, 토마토, 옥수수, 담배, [41]밀 등입니다.

기술적 과제

유전자 타겟팅은 유전체에 표적이 되고 사용자가 정의한 서열 변화나 서열 삽입을 할 수 있는 엄청난 가능성을 가지고 있습니다.그러나 주요 응용 분야인 인간 질병 모델링 및 식물 유전체 공학은 포유류 및 고등 [50]식물 세포에서 경쟁적인 비동형 말단 결합에 비해 낮은 상동 재조합 효율로 인해 방해를 받습니다.상술한 바와 같이, 식물 및 포유동물 [51]세포에서 유전자 타겟팅의 빈도를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 전략들이 있습니다.또한, 유전자 타겟팅이 발생한 세포의 선택 또는 특이적 농축을 가능하게 하는 강력한 선택 방법은 유전자 타겟팅된 [52]세포의 회복 속도를 증가시킬 수 있습니다.

2007년 노벨상

마리오 R. 2007년 카페치, 마틴 J. 에반스, 올리버 스미스시즈는 "배아줄기세포를 [53]이용하여 쥐에게 특정 유전자 변형을 도입하는 원리"에 대한 연구로 노벨 생리학·의학상을 수상했습니다.

유전자 표적생물의 조절

위에서 설명한 바와 같이, 유전자 타겟팅은 기술적으로 단일 염기쌍 돌연변이에서부터 잠재적 형질전환을 포함한 더 긴 서열의 삽입에 이르기까지 다양한 크기의 유전자 변화를 일으킬 수 있습니다.이것은 유전자 타겟팅의 산물이 자연적인 돌연변이와 구별될 수 없거나, 형질전환 유전자의 삽입으로 인해 GMO와 동등할 수 있음을 의미합니다(위의 벤 다이어그램 참조).따라서 유전자 타겟팅의 제품을 규제하는 것은 어려울 수 있으며, 여러 국가들은 유전자 [54][55][56]편집의 제품에 대한 광범위한 규제 검토의 일환으로 다양한 접근법을 취했거나 그렇게 하는 방법을 검토하고 있습니다.널리 채택된 분류는 유전자 편집 [57][16]유기체를 생성하는 데 사용되는 사이트 지향 핵효소(CRISPR-Cas와 같은)를 참조하여 유전자 편집 유기체를 3개의 클래스의 "SDN1-3"으로 나눕니다.이러한 SDN 분류는 어떤 종류의 SDN을 'GMO'로 간주할 것인지에 대한 국가 규제를 안내할 수 있으며, 따라서 이는 잠재적으로 엄격한 규제를 받게 됩니다.

  • SDN1 = DNA에 있는 SDN 촉매 분열의 비동상적 말단 결합을 통해 생성된 유기체.따라서 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ를 통해 무작위 변이가 발생했으며, 복구 템플릿이 사용되지 않았습니다(따라서 유전자 타겟팅이 아님).DNA 수리 템플릿의 사용 부족과 기존 사육 기술과의 동등성 때문에 덜 엄격한 규제 감독을 받는 경우가 많습니다(식물 사육의 경우).
  • SDN2 = 상동성 복구 템플릿을 사용하여 SDN 절단 부위의 표적 유전자에 하나 또는 몇 개의 특정 돌연변이가 도입되었습니다(이를 유전자 타겟팅이라고 가정).
  • SDN3 = 더 긴 서열은 절단 부위에, 상동 재조합(즉, 유전자 타겟팅) 또는 NHEJ를 통해 삽입되었습니다. "더 긴 서열"은 일반적으로 촉진제 또는 단백질 결핍 영역과 같은 전체 유전적 요소를 나타냅니다.이것들은 종종 형질전환으로 간주되며 따라서 종종 [58]GMO로 분류됩니다.

역사적으로 유럽 연합(EU)은 유전자 변형 기술에 대해 예방 원칙을 이유로 광범위하게 반대해 왔습니다.2018년 유럽 사법 재판소(ECJ)는 유전자 편집 작물(유전자 표적 작물 포함)을 유전자[59] 변형된 것으로 간주해야 한다고 판결하여 GMO 사용에 상당한 규제 부담을 주는 GMO 지침의 적용을 받았습니다.하지만 이 결정은 유럽 [60]과학계에서 부정적으로 받아들여졌습니다.2021년 유럽 위원회는 유전자 변형 및 유전자 편집 기술(또는 NGTs – New Genomic Technologies)을 규율하는 현재의 EU 법률이 '목적에 맞지 않는다'고 판단하고 과학 및 기술 [61]발전을 반영하기 위해 적응할 필요가 있다고 판단했습니다.2023년 7월, 유럽 위원회는 유전자 편집으로 개발된 생물체의 규제 요건을 줄이기 위해 유전자 편집의 특정 제품에 대한 규칙을 변경하는 제안서를 발표했습니다.[62]

참고 항목

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외부 링크