프라이머(분자생물학)

프라이머는 DNA 합성을 시작할 때 모든 생물이 사용하는 짧은 단일 가닥 핵산이다.DNA 중합효소(DNA 복제를 담당하는) 효소는 기존 핵산의 3' 말단에 뉴클레오티드를 첨가할 수 있을 뿐이며, DNA 중합효소가 상보적 ^[1]가닥을 시작하기 전에 프라이머가 템플릿에 결합되어야 한다.DNA 중합효소는 RNA 프라이머에 결합 후 뉴클레오티드를 첨가하여 전체 가닥을 합성한다.나중에, RNA 가닥들은 정확하게 제거되어야 하고 그것들을 리게아제라고 불리는 효소를 사용하여 채워진 닉으로 알려진 틈새 영역을 형성하는 DNA 뉴클레오티드로 대체되어야 한다.^[2] RNA 프라이머의 제거 과정은 RNA 뉴클레오티드의 제거와 DNA 뉴클레오티드의 추가를 보장하기 위해 Fen1, Lig1, 그리고 DNA 중합효소와 함께 작동하는 다른 여러 효소를 필요로 한다.살아있는 유기체는 RNA 프라이머만을 사용하는 반면, 시험관 내 DNA 합성을 필요로 하는 생화학 및 분자생물학의 실험실 기술들은 일반적으로 DNA 프라이머를 사용한다. 왜냐하면 그것들은 더 온도가 안정적이기 때문이다.프라이머는 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 특정 반응을 위해 실험실에서 설계할 수 있습니다.PCR 프라이머를 설계할 때 프라이머의 용해 온도 및 반응 자체의 아닐 온도와 같이 고려해야 할 구체적인 측정이 있습니다.또한 프라이머의 시험관내 DNA 결합 배열을 특별히 선택해야 하며, 이는 DNA를 스캔하여 프라이머가 결합할 특이하고 고유한 영역을 찾는 기본 국소 정렬 검색 도구(BLAST)라고 불리는 방법을 사용하여 이루어진다.

생체내 RNA 프라이머

RNA 프라이머는 DNA 가닥의 합성을 시작할 때 생물에 의해 사용된다.프리마아제라고 불리는 효소 클래스는 선행 및 지연된 가닥 모두에서 판독 템플릿 de novo에 상보적인 RNA 프라이머를 추가합니다.프라이머 말단으로 알려진 프라이머의 유리 3'-OH에서 시작하여 DNA 중합효소는 새롭게 합성된 가닥을 확장할 수 있다.DNA 복제의 선두 가닥은 복제 포크와 함께 움직이는 하나의 연속된 조각으로 합성되며, 합성을 시작하기 위해서는 초기 RNA 프라이머만 필요하다.지연사슬에서 템플릿 DNA는 5μ→3μ 방향으로 달린다.DNA 중합효소는 템플릿 스트랜드에 상보적인 3μ→5μ방향의 염기를 첨가할 수 없기 때문에 복제 포크에서 멀어지는 짧은 단편으로 DNA를 '오카자키 단편'으로 합성한다.선두 가닥과 달리, 이 방법은 DNA 합성의 시작과 중단을 반복하여 여러 개의 RNA 프라이머를 필요로 한다.프리마아제는 DNA 템플릿에 따라 DNA 중합효소가 DNA를 합성하기 위해 사용하는 RNA 프라이머를 5µ→3µ ^[1]방향에서 교차시킨다.

DNA 합성을 가능하게 하기 위해 사용되는 프라이머의 또 다른 예는 역전사이다.역전사효소는 상보적인 DNA 가닥을 합성하기 위해 RNA의 템플릿 가닥을 사용하는 효소이다.역전사효소의 DNA 중합효소 성분은 ^[1]합성을 시작하기 위해 기존의 3' 말단이 필요하다.

프라이머 제거

오카자키 단편을 삽입한 후 RNA 프라이머를 제거하고(원핵생물과 진핵생물의 제거 메커니즘이 다름), RNA가 존재했던 틈새를 메우는 새로운 디옥시리보뉴클레오티드로 대체한다.그런 다음 DNA 연결효소는 조각난 가닥들을 함께 결합하여 지연된 ^[1]가닥의 합성을 완성합니다.

원핵생물에서는 DNA 중합효소 I이 오카자키 단편을 이전의 RNA 프라이머에 도달할 때까지 합성한다.그런 다음 효소는 동시에 5μ→3μ 엑소핵산가수분해효소로 작용하여 앞에서 프라이머 리보뉴클레오티드를 제거하고 뒤에 디옥시리보뉴클레오티드를 첨가한다.RNA 프라이머의 중합과 절제 활동은 모두 5µ→3µ 방향으로 일어나며, 중합효소 I은 이러한 활동을 동시에 수행할 수 있으며, 이를 "닉 번역"^[3]이라고 한다.닉 번역은 RNA 프라이머를 제거하고 디옥시리보뉴클레오티드를 첨가하는 중합효소 I의 동기 활성을 말한다.나중에, 그 가닥들 사이의 틈은 DNA 연결효소를 사용하여 봉합된 닉이라고 불립니다.

진핵생물에서 지연된 가닥에서 RNA 프라이머의 제거는 복제의 완료를 위해 필수적이다.따라서 DNA 중합효소 δ에 의해 5μ→3μ방향으로 합성되는 지연사슬로서 DNA의 불연속사슬인 오카자키 단편이 형성된다.그 후 DNA 중합효소가 이전의 오카자키 단편에서 RNA 프라이머의 5' 말단에 도달하면 프라이머의 5' 말단을 뉴클레아제 분해에 의해 제거되는 단일 가닥 RNA 플랩으로 치환한다.RNA 플랩의 분할에는 세 가지 프라이머 ^[4]제거 방법이 포함됩니다.프라이머 제거의 첫 번째 가능성은 플랩 구조 특이적 핵산가수분해효소 1(PEN-1)에 의해 직접 제거되는 짧은 플랩을 만드는 것으로, 이는 5' 돌출된 플랩을 분해한다.이 방법은 RNA 프라이머 ^[5]제거의 짧은 플랩 경로로 알려져 있습니다.RNA 프라이머를 절단하는 두 번째 방법은 RNase를 사용하여 RNA 가닥을 분해하는 것입니다. 진핵생물에서는 RNase H2로 알려져 있습니다.이 효소는 프라이머의 5' 말단에 가까운 뉴클레오티드를 제외한 대부분의 아닐화 RNA 프라이머를 분해합니다.따라서 나머지 뉴클레오티드는 FEN-1을 사용하여 절단된 플랩에 표시된다.RNA 프라이머를 제거할 수 있는 마지막 방법은 롱 플랩 ^[5]경로로 알려져 있습니다.이 경로에서 RNA 프라이머를 연장하고 잘라내기 위해 여러 효소가 동원된다.플랩은 Pif1로 알려진 5' ~ 3' 헬리케이스만큼 길어집니다.플랩에 뉴클레오티드를 Pif1에 첨가한 후 복제단백질A(RPA)에 의해 긴 플랩을 안정화한다.RPA 결합 DNA는 FEN1의 활성 또는 신병을 억제하므로 ^[4]플랩을 절단하기 위해 또 다른 핵산가수분해효소가 투입되어야 한다.이 두 번째 핵산가수분해효소는 헬리케이스 핵산가수분해효소 활성을 가진 DNA2 핵산가수분해효소인데, 이것은 RNA 프라이머의 긴 플랩을 쪼개고, 그리고 나서 FEN1에 의해 쪼개진 두 개의 뉴클레오티드를 남긴다.마지막으로 RNA 프라이머가 모두 제거되면 리게아제1로 알려진 효소를 사용하여 디옥시리보뉴클레오티드가 채워진 오카자키 조각 사이에 결찰이라고 불리는 과정을 통해 칼집이 생긴다.

합성 프라이머 사용

합성 프라이머는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드이며, 보통 DNA로 구성되며, 템플릿 DNA의 특정 부위로 소둔되도록 커스터마이즈될 수 있습니다.용액에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장되기 전에 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 템플릿과 자연 교배한다.합성 프라이머를 만들고 커스터마이즈하는 능력은 DNA 분석을 포함한 다양한 분자 생물학적 접근에 필요한 귀중한 도구임이 입증되었습니다.생어 연쇄 종단 방법과 DNA 배열의 "Next-Gen" 방법 모두 반응을 시작하기 ^[1]위해 프라이머를 필요로 한다.

PCR 프라이머 설계

중합효소 연쇄반응(PCR)은 한 쌍의 맞춤형 프라이머를 사용하여 증폭되는 배열의 반대쪽 끝에서 서로 DNA 신장을 유도합니다.이들 프라이머의 길이는 보통 18~24베이스이며 증폭되는 시퀀스의 특정 업스트림사이트와 다운스트림사이트만을 코드화할 필요가 있습니다.DNA를 따라 여러 영역에 결합할 수 있는 프라이머는 모든 영역을 ^[1]증폭시켜 PCR의 목적을 제거한다.

PCR 프라이머 쌍을 설계할 때는 몇 가지 기준을 고려해야 합니다.프라이머 쌍은 PCR 중 소둔이 두 가닥에서 동시에 발생하므로 용해 온도가 비슷해야 하며, 이 용해 온도는 반응의 소둔 온도보다 너무 높거나 낮으면 안 됩니다.반응의 아닐 온도보다 T(융해 온도)가_m 너무 높은 프라이머는 교배되어 DNA 염기서열을 따라 잘못된 위치에서 확장될 수 있습니다.어닐링 온도보다 현저히 낮은 T는_m 어닐링 및 확장에 전혀 실패할 수 있습니다.

또한 프라이머 배열을 선택하여 DNA 영역에 대해 고유하게 선택함으로써 근처에서 유사한 배열로 교배될 가능성을 방지할 필요가 있다.프라이머 부위의 선택을 위해 일반적으로 사용되는 방법은 BLAST 탐색이며, 여기서 프라이머가 결합할 수 있는 모든 가능한 영역을 볼 수 있다.프라이머 자체뿐만 아니라 뉴클레오티드 배열도 BLAST 탐색할 수 있다.무료 NCBI 도구 Primer-BLAST는 ePrime 및 Beacon Designer와 같은 상용 소프트웨어 제품과 마찬가지로 프라이머 설계와 BLAST 검색을 ^[6]하나의 애플리케이션에 통합합니다.용해 및 아닐 온도 ^[7]등을 부여함으로써 프라이머 설계를 지원하기 위해 이론 PCR 결과(전자 PCR)의 컴퓨터 시뮬레이션을 실행할 수 있다.

2014년 현재, 많은 온라인 툴이 프라이머 설계를 위해 자유롭게 사용 가능하며, 그 중 일부는 PCR의 특정 용도에 초점을 맞추고 있습니다.많은 유사한 변종이 존재하는 DNA 템플릿의 서브셋에 대한 높은 특이성을 가진 프라이머는 DECIPOR를 사용하여^{[citation needed]} 설계될 수 있다.

프라이머 결합을 위해 DNA의 특정 영역을 선택하는 것은 몇 가지 추가 고려사항이 필요합니다.모노뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 반복이 많은 영역은 루프 형성이 발생하고 교잡 불량의 원인이 될 수 있으므로 피해야 한다.프라이머는 혼합물의 다른 프라이머와 쉽게 소둔되어서는 안 됩니다. 이러한 현상은 엔드 용액을 오염시키는 '프라이머 다이머' 제품의 생산으로 이어질 수 있습니다.프라이머는 또한 내부 헤어핀과 루프가 템플릿 DNA를 통한 아닐링을 방해할 수 있기 때문에 스스로 강하게 아닐링해서는 안 됩니다.

프라이머를 설계할 때, 각 프라이머의 백엔드에 추가 뉴클레오티드 염기를 추가할 수 있으며, 결과적으로 증폭된 영역의 양 끝에 맞춤형 캡 시퀀스를 생성할 수 있습니다.이 프랙티스의 한 가지 적용은 PCR과 유사한 특수 서브클로닝 기술인 TA 클로닝에 사용하는 것으로, 여기서 5' 및 3' ^[8]단부에 AG 테일을 추가하여 효율성을 높일 수 있다.

퇴화 프라이머

상황에 따라서는 디그레이드프라이머의 사용이 필요할 수 있습니다.이것들은 유사하지만 동일하지 않은 프라이머의 혼합물입니다.이것들은 다른 유기체로부터 같은 유전자를 증폭시킬 때 편리할 것이다. 왜냐하면 배열은 비슷하지만 동일하지 않기 때문이다.이 기술은 유전자 코드 자체가 퇴화되기 때문에 유용하다. 즉, 여러 개의 다른 코돈이 같은 아미노산을 코드화할 수 있다는 것을 의미한다.이것은 다른 유기체들이 매우 유사한 단백질을 코드하는 상당히 다른 유전자 서열을 가질 수 있게 해준다.이 때문에 코돈의 특정 배열을 알 수 없기 때문에 프라이머 설계가 단백질 배열을 기반으로 하는 경우에도 퇴화 프라이머가 사용된다.따라서, 아미노산 이소류신에 해당하는 프라이머 배열은 "ATH"일 수 있으며, 여기서 A는 아데닌, T는 티민, H는 아데닌, 티민 또는 시토신을 나타내며, 퇴화 염기에 대한 IUPAC 기호를 사용한다.축퇴 프라이머는 타깃 시퀀스와 완전히 혼성되지 않을 수 있으며, 이로 인해 PCR 증폭의 특이성을 크게 낮출 수 있습니다.

퇴화 프라이머는 미생물 생태학 분야에서 널리 사용되고 매우 유용하다.그들은 지금까지 배양되지 않은 미생물의 유전자를 증폭시키거나 게놈 정보를 이용할 수 없는 유기체로부터 유전자를 회복할 수 있게 한다.보통 퇴화 프라이머는 GenBank에서 발견된 유전자 배열 배열에 의해 설계된다.배열 간의 차이는 개별 염기에 대한 IUPAC 퇴화를 사용함으로써 설명된다.이어서 코돈 배열의 모든 배열에 대응하는 프라이머의 혼합물로서 PCR 프라이머를 합성한다.

「 」를 참조해 주세요.

• 올리고뉴클레오티드합성– 프라이머 제조방법

레퍼런스

외부 링크

• 프라이머 3
• 프라이머-블라스트